菌种选育方法.ppt

生物工艺学主要内容2.2.6DNA重组技术4基因工程过程示意图基因工程过程流程图限制性内切酶一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。DNA连接酶DNA连接酶的作用过程运载体质粒（一）目的基因的获取基因组DNA文库举例：碱性磷酸酶基因工程菌的构建2质粒DNA的提取3DNA重组－限制性酶切和连接酶切片段的回收连接大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化重组子筛选-蓝白筛选DNA重组－重组子的筛选及表达菌株的转化外源基因在大肠杆菌中的诱导表达工程菌的稳定性问题工程菌不稳定性的表现(倾向)工程菌不稳定性的原因防止或降低工程菌的不稳定性施加选择压力防止或降低工程菌的不稳定性(续)2.2.7菌种保藏菌种退化原因菌种保藏的原理和方法A斜面冰箱保藏法国内常用。适合于产孢子或芽孢的微生物。
首先，将沙与土洗净烘于过筛后，按沙与土的比例为主1-2：1混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右，121℃间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用80目过筛，土用80一100目过筛。
其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置于干燥器中用真主泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为1年左右。50C石蜡油封存法是目前常用的较理想的一种方法。
其基本原理是在较低的温度下(-15℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此，菌种可以保存很长时间，一般5年左右。这种方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓿管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。
保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构签防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。54E液氮超低温保藏法a原理
用液氮能长期保存菌种。这是因为液-氮的温度可达一195~C，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(一130~C)，所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。
b操作方法及步骤
(1)安瓿管要求由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂。
(2)菌种准备及分装因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为10%的甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓿管中，一般安瓿管的装量为0.2一lmL。(3)冻结液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。
美国ATCC先将菌液降温到0℃，再以每分钟降低l℃的速度，一直降低到一35℃，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加。
(4)重新培养当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或35-40℃水浴中迅速解冻，当升温至0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。我国国内目前已有部分单位采液氮法保存菌种。国内外主要菌种保藏机构介绍IAM(1nstituteOfAppliedMicrobiology)，UniversityofTokyo
日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。
IFO(1nstitute·forFermentation)，Osaka，Japan．
发酵研究所，日本大阪。
KCC(KakenChemicalCompanyLtd)，Tokyo，Japan．
科研化学有限公司，日本东京。NCTC(NationalCollectionOfTypeCulture)，LondonUnitedKingdom
国立标准菌种收减所，英国伦敦。
NIH(NationalInstitutesOfHealth)，Bethesda，Maryland，U．S．A．国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。
NRRLNorthernUtilizationResearchandDepartmentOfAgriculture,Peoria，U．S．A．
美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)
中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌，细菌。
中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-IV)：病毒。
农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)；
中国农业科学院土壤肥料研究所。
林业微生物菌种保藏中心”
由中国林科院负责组成。1994年由森保所代管。
工业微生物菌种保藏管理