菌种选育与培养.doc

第三章菌种选育与培养教学目的：1、熟悉工业发酵常用微生物种类；2、掌握菌种分离、筛选和选育的方法；3、掌握种子扩大培养方法和质量控制方法；4、掌握常规的菌种保藏方法。教学方法：讲授教学手段：使用多媒体课件教学内容：第一节重要工业微生物的分离及菌种要求1、微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。2、有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。3、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。4、由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。一、工业生产常用的微生物1、细菌（bacteria）：枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等；2、酵母菌（yeast）：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等；3、霉菌（mould）：根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等；4、放线菌（actinomycetes）：链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等；5、担子菌（basidiomycetes）：通常所说菇类（mushroom）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发；6、藻类（algae）：用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能。二、微生物工业对菌种的要求目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求：1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高；2、易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短；3、抗杂菌和噬菌体的能力强；4、菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。三、重要工业微生物的分离分离是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。1、施加选择压力的分离方法（1）富集液体培养富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。方法的要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件。例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。（2）固体培养基的使用该方法常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有该酶的作用底物。2、随机分离方法（1）抗生素产生菌的筛选（2）生长因子产生菌的筛选生长因子如氨基酸和核苷酸等的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检验出产生菌。（3）多糖产生菌的筛选可从菌落的粘稠外观识别这类产生菌。第二节工业微生物菌种的选育一、自然选育定义：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。1、从自然界分离获得菌株一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。2、从自发突变体中获得菌株自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株-诱变育种。二、诱变选育定义：使用诱变剂对菌种进行人工诱变，提高突变频率和扩大变异谱的育种方法。具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。1、诱变育种的主要环节：（1）出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株（parentstrain）。一般有三种：从自然界分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株；已经诱变过的菌株。选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响。不仅选产量高的，还要考虑其他因素，如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等有利于合成发酵产物的特性。选择对诱变剂敏感且变异幅度广的菌株作为出发菌株，可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。（2）菌悬液的制备（3）前培养（4）诱变物理诱变剂：各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、β射线、γ射线、α射线和超声波等；化学诱变剂：甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。诱变剂诱变剂的剂量处理时间缓冲剂中止反应方法亚硝酸（HNO2）0.01～0.1mol/L5～10minpH值4.5，1mol/L醋酸缓冲液pH8.6，0.07磷酸二氢钠硫酸二乙酯（DES）0.5～1％10～30mi