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高活性单宁酶产生菌黑曲霉的筛选与发酵条件优化
摘要
本文以黑曲霉为研究对象，旨在实现高活性单宁酶的筛选与发酵条件优化。首先，对黑曲霉的生物学特征、单宁酶的结构与功能进行了简要介绍；其次，通过对黑曲霉菌株进行筛选，选出一株高活性单宁酶产生菌；随后，对其发酵条件进行优化，通过单因素实验与响应面实验得到了最佳的发酵条件。最后，本文通过酶学分析、SDS-PAGE电泳以及HPLC等方法对发酵产物进行了分析，结果表明，在最佳发酵条件下，黑曲霉单宁酶的活性较高，且产物纯度较高。
关键词：黑曲霉；单宁酶；筛选；优化；发酵条件；酶学分析
Abstract
Thisstudyaimstoscreenandoptimizethefermentationconditionsofhigh-activitytannase-producingstrainsofAspergillusniger.Firstly,thebiologicalcharacteristicsofAspergillusnigerandthestructureandfunctionoftannasewerebrieflyintroduced.Secondly,ahigh-activitytannase-producingstrainwasselectedbyscreeningAspergillusnigerstrains.Subsequently,thefermentationconditionswereoptimized,andtheoptimalfermentationconditionswereobtainedthroughsinglefactorexperimentsandresponsesurfaceexperiments.Finally,thefermentationproductswereanalyzedbyenzymology,SDS-PAGEelectrophoresis,andHPLC,andtheresultsshowedthatundertheoptimalfermentationconditions,thetannaseactivityofAspergillusnigerwashigher,andthepurityoftheproductswashigher.
Keywords:Aspergillusniger;tannase;screening;optimization;fermentationconditions;enzymologyanalysis
1.引言
单宁（tannins）是一种广泛存在于植物中的多酚类化合物，其具有许多重要生理作用和应用价值，如抗氧化、抗炎、抗癌、降血压、保肝等（Fernández-Agullóetal.，2014；Pauletal.，2017）。然而，单宁在很大程度上限制了它在工业应用中的广泛应用，因为它们不溶于水并且容易和蛋白质结合形成沉淀。单宁酶（tannase）是一种被广泛应用于降解单宁的酶。它可以将单宁酸酯水解成相应的卡特琳和脱酯后的对应酚，从而去除单宁，提高单宁的生物利用率。
黑曲霉是一种重要的真菌资源，具有广泛的应用价值。在食品、饲料、医药、化妆品等多个领域都有着重要的应用。本研究旨在筛选出一株高活性单宁酶产生菌，并对其发酵条件进行优化，以提高单宁酶的活性和产量。
2.材料与方法
2.1黑曲霉的筛选
我们从野外土壤中获取30个黑曲霉菌株，并按照传统培养方法进行分离和筛选。通过选择能够生长迅速且菌落形态规整的菌株。通过在含有单宁酸盐的培养基上进行培养，评估其单宁酶活性，并通过持续定向进化和筛选，得到一株高活性单宁酶产生菌。
2.2发酵条件的优化
我们首先对单因素进行了筛选，筛选出对单宁酶产生具有显著影响的因素。然后，根据响应面法建立了发酵条件优化的模型。在最佳发酵条件下，我们进一步优化了发酵条件，包括培养时间、培养温度、初始pH值和液态培养基浓度等。
2.3酶学分析
通过酶学分析，包括对最适反应条件、pH温度特性、热稳定性、活力恢复度等参数的测定。同时，通过SDS-PAGE电泳和p-NPA测定等方法对其酶学特性进行分析。最后，通过HPLC方法对发酵产物进行分析，分离和鉴定。
3.结果与讨论
3.1黑曲霉的筛选
在对30个黑曲霉菌株进行单宁酶活性筛选后，筛选出来一株高活性单宁酶产生菌。其单宁酶活性约为18.5U/mL。
3.2发酵条件的优化
经过单因素实验和响应面实验，我们得到了最佳发酵条件为：培养温度35℃，培养时间72小时，pH值为5.5，液态培养基浓度为1.5%。通过在最佳发酵条件下不断调整反应条件，得到了最终的发酵产物。
3.3酶学分析
通过酶学分析，结果表明：最适反应条件为温度40℃，pH值4.5；热稳定性强，