实验十二---土壤中微生物的分离纯化-PPT.ppt

实验十二土壤中微生物的分离及纯化（设计性实验）一、目的要求二、基本原理（二）如何分离？
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征（产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等）鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
（三）平板菌落计数法的原理
将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度（一般选择每个平板上长有50-200个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适）。
由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。因此，平板菌落记数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。
该法虽然操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该方法能直接反映样品中活细胞数量，所以被广泛用于生物制品（如活菌制剂）、食品、饮料、水（包括水源水）以及多类产品等质量检测与控制的标准方法。快速细菌自动稀释仪和自动菌落计数仪则提供快速准确的结果。培养基的类型？
三、实验器材四、操作步骤2、稀释土样
制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
减小误差应注意的方面：
①称量准确；
②土样与水混合，一定要摇匀；
③每次稀释取液应换一支新的吸管；
④每次取液时应先混匀试管中的溶液；各培养基涂布菌液时对稀释度的选择：
牛肉膏蛋白胨培养基10-4、10-5、10-6；
高氏一号培养基：10-3、10-4、10-5；
马铃薯培养基：10-2、10-3、10-4；平板分离3、涂布：
①标记：选择3个稀释度写在平板底部；
②取样：每皿准确取悬液0.2ml，放于平板中央；（注意每次取液时应先混匀试管中的溶液）
③涂布：在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向90°沿另一垂直线来回推动，平板内缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置5～10分钟；
注意涂棒的正确使用。4、培养：
将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基的平板倒置于28℃温室中培养3～5天，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板倒置于37℃温室中培养1～2天。

5、记数：
培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位(cfu)
=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

6、镜检纯培养：挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。五、实验报告六、思考题