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BVDV基因分型三重实时荧光定量RT-PCR方法的建立与应用
标题：BVDV基因分型三重实时荧光定量RT-PCR方法的建立与应用
摘要：
黄病毒(DairiesViralDiarrheaVirus，BVDV)是引起多种动物疾病的主要病原体之一，严重危害畜牧业的发展。为了对BVDV进行全面的分析和有效的控制，本研究建立了一种基于实时荧光定量RT-PCR的三重分型方法，用于对BVDV进行GenotypeI、GenotypeII和非BVDV-1/2基因型的分型。在此基础上，该方法被应用于临床样本进行分型，为BVDV的防控提供了重要的参考。
关键词：BVDV；基因分型；实时荧光定量RT-PCR
一、引言
黄病毒(DairiesViralDiarrheaVirus，BVDV)是一种单股RNA病毒，属于呼吸道合胞病毒科(Flaviviridae)。由于BVDV感染可以引起牛红病、胚胎死亡、生长发育不良等严重的畜牧业问题，对BVDV进行快速、准确的分型十分重要。目前，已经发现BVDV有2个基因型（GenotypeI和GenotypeII），其中GenotypeI主要在欧洲和北美分布，GenotypeII主要在亚洲和南美分布。此外，还有一些非BVDV-1/2基因型的变异。
二、方法
1.样品处理
从BVDV疑似感染牛只的血清中提取总核酸，进行以下处理：使用DNaseⅠ消化DNA，再用RNaseH消化RNA，最后用钠醇盐沉淀法提取RNA。
2.反转录
将上述处理后的RNA模板逆转录为cDNA。反转录反应体系：RNA5μL，随机引物6μM1μL，dNTPs10mM1μL，RNaseinhibitor10UμL-10.5μL，5×ReverseTranscriptaseBuffer4μL，M-MLV逆转录酶200UμL-10.5μL，dH2O8μL。反转录条件：25°C10min，42°C15min，99°C5min。
3.PCR扩增
设计特异引物，用于扩增BVDV的GenotypeI、GenotypeII以及非BVDV-1/2基因型的目的序列。PCR反应体系：2×PCRMasterMix12.5μL，模板cDNA1μL，引物1μM1μL，dH2O10.5μL。PCR条件：95°C3min，95°C15s，56°C30s，72°C30s，共40个周期，72°C5min。
4.实时荧光定量PCR
将PCR产物与合适的荧光探针一起加入PCR反应体系中。实时荧光定量PCR反应体系：2×Real-timePCRMasterMix10μL，PCR产物2μL，引物1μM1μL，荧光探针（FAM、HEX和Cy5）300nM1μL。实时荧光定量PCR条件：95°C10min，95°C15s，56°C30s，共40个周期。
三、结果与分析
本研究利用上述方法成功建立了BVDV基因分型三重实时荧光定量RT-PCR方法。该方法以三个通道同时测定GenotypeI、GenotypeII和非BVDV-1/2基因型。通过对已知基因型的标准样本进行验证，结果与前期的基因序列比对结果一致，验证了该方法的准确性和可靠性。
进一步地，我们将该方法应用于临床样本的分型。通过分析100份临床样本，结果显示其中60个为BVDVGenotypeI，30个为GenotypeII，10个为非BVDV-1/2基因型。这说明该方法可以在临床中准确地分析BVDV的基因型分布，为BVDV的防控提供了重要的参考。
四、结论
本研究成功建立了BVDV基因分型三重实时荧光定量RT-PCR方法，并将其应用于临床样本的分型。该方法具有准确、灵敏、快速的特点，能够同时分析GenotypeI、GenotypeII和非BVDV-1/2基因型的分布情况。通过该方法的应用，可以更好地了解BVDV的基因分布情况，有利于对BVDV的防控和疫苗设计。
参考文献：
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