免疫标记技术.ppt

免疫学实验技术免疫标记技术免疫学技术--抗原抗体反应免疫标记技术免疫标记技术是用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应

荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定

敏感性、特异性、精确性及应用范围
抗原抗体反应＋酶催化反应
肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计
特异、敏感
可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。
（一）基本原理（二）常用的酶及其底物（三）标记方法戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶

改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG
（四）酶标记物的纯化及鉴定2、鉴定

免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA

酶标记率测定：分光光度法（五）固相酶免疫测定仪（酶标仪）（六）类型酶免疫组织化学技术：检测组织或细胞中抗原或抗体
酶免疫测定：用酶标记抗原或抗体做标记物，检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。
根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标记物分离，分为均相和异相
均相：酶标抗原+非标记抗原+限量抗体，酶标记物发生抗原抗体反应后，酶活性减弱或增强。
异相：反应后，分离形成复合物的酶标记物并检测。根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分为液相和固相。
液相：待测抗原+酶标抗原+抗体，一次性温育
待测抗原+抗体，温育，加酶标抗原，温育
固相：固相预先吸附抗原或抗体，在其表面反应(酶)免疫组织化学（免疫细胞化学）：指带显色剂（酶）标记的特异性抗体或抗原在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原或抗体进行定性、定位、定量测定的技术。

免疫反应特异性
组织化学的可见性免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于荧光免疫组化技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的酶免疫组化技术。
荧光免疫组化技术局限性：荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清
酶免疫组化技术：能克服上述不足，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。

步骤：
抗原的提取与纯化
免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化
标记抗体
标本处理
抗原抗体反应和呈色反应
显微镜观察标本
取材新鲜、固定及时、形态保存良好、抗原性不被破坏

活体组织切片或印片
各种体液、穿刺液（细胞沉淀涂片）
培养细胞
1标本的固定与保存：
固定使细胞内蛋白凝固，终止胞内酶活化，防止细胞自溶，保存抗原性
固定剂：乙醇、丙酮、戊二醛等
切片：冰冻、石蜡
2酶消化：打开固定过程中由于醛键形成而被封闭的抗原决定簇（胃蛋白酶等）3免疫染色
标记抗体与标本中抗原反应形成复合物，洗去未结合成分，直接镜检。对照试验（control）：
Positive：已知抗原阳性的切片
Negative：不含已知抗原的切片
空白对照：排除组织自发荧光、内源性酶、生物素等4结果观察

染色特异性染色非特异性染色
显色部位特定细胞或间质细胞或间质均匀染
色或更强
显色定位特定，有结构性无特定部位，无结
构性
显色程度同一部位呈不同无分布规律，某一片
程度显色均匀着色

非特异性染色：非抗原抗体反应出现的阳性染色。
原因：非特异性蛋白吸附于高电荷的胶原或结缔组织上。
防止方法：采用与第二抗体相同来源的动物血清吸附封闭底物组织上的带电物质；2%牛或人白蛋白封闭。（二）EIHCT类型

1、酶标记抗体免疫组化技术
将酶通过交联剂结合在抗体（抗抗体）分子上，形成酶标记抗体（抗抗体），与标本中相应抗原或抗原抗体复合物反应后，再经酶对底物显色，对标本中抗原进行定性和定位。

2、非标记抗体酶免疫组化技术
用酶免疫动物制备抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合，然后用第二抗体（Ab2）作桥，Ab2既可与Ab3Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的Ab1Fc段结合。酶显色。1、酶标记抗体免疫组化技术类型：
（1）直接法：■-Ag+Ab*E→■-Ag-Ab*E
优点：简单、快速、特异
缺点：一种酶标抗体只能测一种抗原，敏感性较差
（2）间接法：■-Ag+Ab1+Ab2*E→
■-Ag-Ab1-Ab2*E
优点：一种酶标抗体能测多种抗原，实用性敏感性较直接法好
缺点：敏感性低于非标记抗体酶法与三步法2、非标记抗体酶免疫组化技术类型：
（1）酶桥法：■-Ag+Ab1(兔源)+Ab2(羊抗兔)+抗-HRP(兔源)+HRP
（2）PAP法：过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP），预先制成复合物
减少操作步骤
（3）双桥PAP法：■-Ag-Ab1(兔源)-Ab2(羊抗兔)-PAP-Ab2(羊