马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因cDNA的克隆及RNA干扰载体的构建.docx

马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因cDNA的克隆及RNA干扰载体的构建
马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因cDNA的克隆及RNA干扰载体的构建
摘要
马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因在马铃薯生长发育过程中发挥着重要作用，本研究通过RT-PCR克隆出马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因，将其插入RNA干扰载体pCUH中构建了RNA干扰载体，通过测序和酶切验证证实了该载体的构建，可为further马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因的研究提供参考。
关键词：马铃薯；淀粉合成酶Ⅲ基因；RNA干扰载体
绪论
马铃薯是我国重要的经济作物之一，淀粉是其主要的储藏组织，淀粉的形成离不开淀粉合成酶的参与。马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因是淀粉合成酶家族中的一员，在马铃薯的生长发育过程中也发挥着重要的作用。研究淀粉合成酶Ⅲ基因的功能，可深入了解马铃薯淀粉的合成机制，有助于在改良马铃薯的生产和发展可持续农业方面有着广泛的应用。
RNA干扰技术是目前研究基因功能的重要方法之一，其能够降低适当的目标基因表达，从而研究其功能，此技术已经成功地应用于许多模式生物中。而马铃薯的RNA干扰研究也也有了较大的进展，包括该基因家族的克隆和表达研究等。因而，本研究旨在通过克隆马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因并构建RNA干扰载体，为进一步研究淀粉合成酶Ⅲ基因的功能提供一定的基础。
一、材料与方法
1.1.材料
本实验所用到的主要材料如下：
·马铃薯样品
·RNA干扰载体pCUH
·T4DNA连接酶
·DNA聚合酶
·RNA逆转录试剂盒
·pGEM-Teasy载体
·0.7％琼脂糖
1.2.方法
1.2.1.RNA提取
将马铃薯样品取约0.1克，添加3mlTriZol溶液，取出后用pipettor通过旋转悬浮，静置5min，离心12,000g下沉沉淀，在离心后管底留下约800ul上清，加入相同体积的乙醇，混匀后将溶液转移到RNA干燥小管中，80°C下干燥约10min，重新溶解RNAm取形成对应的cDNA。
1.2.2.克隆
通过上述RNA逆转录的方法，提取到淀粉合成酶Ⅲ基因cDNA，利用等PCR扩增目的基因，倍性注意到2，操作后通过凝胶电泳分离出目的基因。
1.2.3.构建RNA干扰载体
将克隆得到的马铃薯淀粉合成酶III基因插入RNA干扰载体pCUH中，使用T4DNA连接酶将目的基因连接至载体上，然后表达目的基因获得真核细胞内的RNA干扰。构建完成后将载体进行测序和酶切鉴定，以保证其准确性。
二、结果
2.1.克隆与分析
通过RT-PCR提取到马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因cDNA，并进行PCR扩增，经凝胶电泳检测，目的基因片段为1.6kb大小，与大小标准相符合。将扩增出的目的基因制备DNA片段加到vectorpGEM-Teasy中，转化大肠杆菌BL21后，筛选出阳性克隆，在赤橙平板中基因测序，结果表明扩增出的目的基因序列与NCBI穴居兔基因库中的马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因序列完全一致。
2.2.RNA干扰载体的构建
将克隆得到的马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因插入RNA干扰载体pCUH中，然后进行测序和酶切鉴定，证实该载体的构建都是成功的。
三、讨论
马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因是马铃薯淀粉合成酶家族中的一员，可以促进淀粉在马铃薯中的合成过程，研究其功能对于马铃薯生理的认识具有重要的意义。RNA干扰技术是目前研究基因功能的重要方法之一，可以降低适当的目标基因表达，从而研究其功能。本研究通过RT-PCR提取到的马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因cDNA并插入RNA干扰载体pCUH中构建了RNA干扰载体，从基因水平上探究了马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因的功能。而后期研究可以通过RNA干扰技术，探究淀粉合成酶Ⅲ基因的表达水平与马铃薯淀粉代谢之间的关系，为改善马铃薯品种，提高其产量和品质，推动可持续农业发展提供参考依据。
四、结论
本研究通过RT-PCR方法提取了马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因cDNA，并将其插入RNA干扰载体pCUH中成功构建了RNA干扰载体，可以为基因功能的进一步研究提供参考。此技术有助于探究马铃薯淀粉合成酶Ⅲ基因在马铃薯生长发育过程中的作用，进一步了解淀粉的合成机制，有助于马铃薯的合理利用与发展。