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油茶泛素结合酶E2基因全长cDNA克隆及其RNAi干扰载体的构建
摘要
本研究旨在克隆油茶中泛素结合酶E2基因的全长cDNA序列，并构建其RNAi干扰载体。研究采用RT-PCR方法克隆了油茶中E2基因的全长cDNA序列，并对其进行了生物信息学分析。进一步利用RNA干扰技术，构建了E2基因的RNAi干扰载体，并进行细胞转染实验。结果表明，油茶中E2基因的全长cDNA序列长为805bp，编码266个氨基酸，预测蛋白质的相对分子质量为29.96kDa，等电点为5.58。研究还发现E2基因在油茶的各个组织中均有表达，且表达量最高的组织为种子。RNAi实验结果显示，E2基因RNAi干扰后能够显著抑制细胞的生长和分裂，拓展了对油茶中E2基因的研究。
关键词：油茶，泛素结合酶E2基因，RNAi干扰载体，细胞转染
Abstract
Theaimofthisstudywastoclonethefull-lengthcDNAsequenceofubiquitin-conjugatingenzymeE2geneinCamelliaoleiferaandconstructitsRNAiinterferencevector.Thefull-lengthcDNAsequenceofE2geneinCamelliaoleiferawasclonedbyRT-PCRandanalyzedbybioinformatics.Furthermore,RNAinterferencetechnologywasutilizedtoconstructRNAiinterferencevectorofE2gene,andcelltransfectionexperimentwasperformed.Theresultsshowedthatthefull-lengthcDNAsequenceofE2geneinCamelliaoleiferawas805bp,encoding266aminoacids,andthepredictedrelativemolecularweightofproteinwas29.96kDaandtheisoelectricpointwas5.58.TheexpressionofE2genewasobservedinalltissuesofCamelliaoleifera,andthehighestexpressionwasinseeds.RNAiinterferenceexperimentshowedthatthegrowthanddivisionofcellscouldbesignificantlyinhibitedafterE2geneRNAiinterference,whichexpandedtheresearchonE2geneinCamelliaoleifera.
Keywords:Camelliaoleifera,ubiquitin-conjugatingenzymeE2gene,RNAiinterferencevector,celltransfection
引言
泛素结合酶E2基因是泛素系统中一个重要的组成部分，能够参与蛋白质的降解、修饰和转运等过程。泛素系统是维持细胞内稳态的重要生物学过程，对于细胞生长、分化、凋亡以及计算机进程等方面都具有重要作用。近年来，越来越多的研究发现泛素系统与植物生长发育密切相关，而油茶作为一种重要的经济作物，在泛素系统中的研究却非常有限。因此，本研究旨在克隆油茶中泛素结合酶E2基因的全长cDNA序列，并构建其RNAi干扰载体，为深入研究泛素系统与油茶生长发育之间的关系提供基础研究支持。
材料与方法
1.材料
本研究所用的油茶样品来自江西省乐平市某油茶种植基地，种子、叶片和花朵分别作为样品进行研究。
2.克隆E2基因的全长cDNA序列
利用TRIzol试剂将油茶各组织的总RNA提取，制备cDNA模板，利用E2基因的保守序列设计引物，进行RT-PCR扩增E2基因的全长cDNA序列。
3.生物信息学分析
利用NCBI的软件，分析E2基因的生物信息学特性，包括理化性质、亚细胞定位、同源性等方面。
4.构建RNAi干扰载体
利用RNAi技术，设计合适的引物片段，克隆E2基因的siRNA序列。然后构建siRNA表达载体，并进行细胞转染实验。
5.细胞转染实验
将E2基因的RNAi干扰载体转染入油茶细胞中，利用显微镜观察细胞生长情况，采用MTT法检测细胞增殖能力，利用流式细胞术检测细胞周期。
结果
1.克隆E2基因的全长cDNA序列
利用RT-PCR技术，成功从油茶中克隆了E2基因的全长cDNA序列。序列长度为805bp，含有一个开放阅读框，编码266个氨基酸。
2.生物信息学分析
对克隆得到的E2基因全长cDNA序列进行