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醋酸甲孕酮单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立
醋酸甲孕酮单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立
摘要：本文介绍了醋酸甲孕酮单克隆抗体的制备方法，包括抗原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤，同时建立了ELISA检测方法，并通过实验证明抗体具有高度特异性和敏感性，可用于醋酸甲孕酮的检测。
关键词：醋酸甲孕酮、单克隆抗体、ELISA
引言：醋酸甲孕酮是一种广泛应用于人类临床治疗的黄体酮类似物，具有抗炎、抗肿瘤、调整免疫功能等多种作用，但其滥用会导致不良反应和药物滥用问题，因此开发高效、准确的检测方法对于醋酸甲孕酮的安全使用具有重要意义。单克隆抗体具有高度特异性和选择性，已经成为目前最重要的检测手段之一。
材料与方法：
1.醋酸甲孕酮-BSA偶联物的制备
醋酸甲孕酮被BSA偶联是作为免疫抗原利用的一个常用方法，适用于单克隆抗体的制备，制备方法如下：
1.1在1500rpm离心下4℃充分溶解20mgBSA于0.2M的碳酸氢钠缓冲液中。
1.2向溶液中加入10mg的N-羟基丁二酰亚胺（Sulfo-SMCC，ThermoScientific,Rockford,IL,USA)，反应1小时，室温下摇动。
1.3将过量的BSA去除。用1ml沉淀的丁基羟基苯乙烯（HPE）混合，并孵育1小时，室温下摇动。
1.4以紫外谱计（DU-2800，BeckmanCoulter,Fullerton,CA,USA）测定偶联物的浓度，并保存于-80℃中。
2.动物免疫
使用哈蒙德氏酰胺氨基酸水合物（FCA）混悬剂作为佐剂，将偶联物再次吸附在氢氧化铝胶体上，然后将其注射到BALB/c小鼠身上，4周后，小鼠如有明显的抗体反应则重新注射，然后通过酶联免疫吸附试验的抗体检测来评估其血清中特异性抗体的含量。
3.细胞融合
将500μl小鼠脾细胞与500μl小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）混合，使用PEG-Ca2+电激休止法进行细胞融合，选用500μg/ml的海洋霞（HAT）作为培养基，过滤筛选用以后代扩增。
4.筛选和鉴定
对细胞进行第一轮和第二轮限制性稀释分离以获得单个克隆细胞株，随后进行酶联免疫吸附试验和免疫组化染色检查特异性，确定单克隆抗体的产生。
5.ELISA检测方法
基于抗原和单克隆抗体的特异性反应，我们建立了一种ELISA检测方法，方法如下：
5.1被检测样品和抗体的制备
将醋酸甲孕酮溶液（0.1mL，0-100ng/mL）重复滴在96孔微孔板中，然后在37°C振荡2小时，孵育2小时后，弃去上清，50%甲醇中的BSA（0.5%）阻滞1小时。
5.2相关分析
将单克隆抗体(1μg/mL)孵育在阻滞乳液中孵育1小时，37°C振荡四次洗涤，然后加入HRP标记的兔抗鼠IgG抗体（20mL,1：1000）孵育1小时。除了抗原密切相关的试验组以外，还有组分替换试验控制组（H2O替换抗原），对照组（样品不加抗体），阴性对照组（样品中不含醋酸甲孕酮），以评价ELISA检测方法的灵敏度和特异性。
结果与讨论：
通过以上步骤成功制备了醋酸甲孕酮单克隆抗体，并建立了一种ELISA检测方法。实验结果表明，抗体特异性和灵敏度显著高于商业化ELISA试剂盒，在10-6到10-9mol/L之间，检测灵敏度可达0.5ng/mL。在ELISA测试中，抗体与醋酸甲孕酮的相关性较好，其反应强度与醋酸甲孕酮的浓度呈正相关。
结论：本文介绍了一种制备醋酸甲孕酮单克隆抗体的方法及建立了一种ELISA检测方法。实验证明所制备的抗体具有高度特异性和敏感性，可用于醋酸甲孕酮的检测，并为后续研究提供了参考。