环丙沙星单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立.docx

环丙沙星单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立
环丙沙星（Ciprofloxacin）是一种广谱抗生素，属于喹诺酮类抗生素，可以有效地抑制大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的生长。随着环境污染、人口增长和抗生素的滥用，环丙沙星的残留量也在不断增加，成为影响环境和人类健康的重要因素之一。因此，快速、准确地检测环丙沙星在食品、环境等样品中的含量，具有十分重要的意义。
本研究利用环丙沙星制备环丙沙星单克隆抗体和建立ELISA检测方法，以期为环丙沙星的检测提供一种新方法。
一、环丙沙星单克隆抗体的制备
1.1材料和方法
1.1.1材料
环丙沙星（Ciprofloxacin）、生化牛清、小鼠脾脏细胞、Fusogen6（BaidaiBiotechCo.，Ltd），SPFBALB/c小鼠。
1.1.2方法
Ⅰ、脾细胞融合制备小鼠单克隆抗体
1、小鼠免疫和筛选
在小鼠背部注射环丙沙星纯化蛋白（100μg/只）和完全弱化的Freunds佐剂（1:1），共免疫三次，免疫间隔2周。采用间接ELISA法检测小鼠血清中环丙沙星特异IgG抗体的滴度，选择滴度最高的小鼠进行脾细胞的收集。
2、细胞融合
将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0混合，用PEG进行细胞融合。
3、杂交瘤筛选
将细胞混合物过筛并耗时地进行逐层稀释，并于96孔板中培养，筛选出亲和力最强的杂交瘤细胞。
Ⅱ、单克隆抗体的鉴定和纯化
1、鉴定单克隆抗体的类型
以间接ELISA法鉴定单克隆抗体的同种型。选择具有特异性的同种型抗体作为检测抗体。
2、鉴定抗体的亲和力和特异性
使用ELISA法鉴定抗体的亲和力和特异性。
3、抗体纯化
将杂交瘤细胞培养液进行离体后，用ProteinA亲和层析法纯化单克隆抗体。
二、ELISA检测方法的建立
2.1材料和方法
2.1.1材料
捕获抗原：环丙沙星-BSA（主要相应的环丙沙星结构域与牛血清白蛋白偶联而成的捕获抗原）和兔抗鸭抗人IgG抗体。
检测抗体：环丙沙星单克隆抗体。
酶标记二抗：HRP标记的抗小鼠IgG二抗。
底物：3,3',5,5'-四甲基联苯二胺（TMB）。
其他试剂：PBS、Tween-20、BSA、二甲基亚磷酸胆碱盐（DMAB）、过氧化氢（H2O2）等。
2.1.2方法
以竞争ELISA法为基础，建立环丙沙星的ELISA检测方法，具体步骤如下：
1、制备检测板
板是96孔的聚合物板。将环丙沙星-BSA和兔抗鸭抗人IgG抗体按一定配比涂覆在板上。其中，环丙沙星-BSA浓度为5μg/mL，兔抗鸭抗人IgG抗体浓度为1:2000。
2、样品预处理
将待检样品与PBS-Tween20混合液按一定比例混合，处理样品。
3、样品加入板内进行检测
将处理的样品加入涂有环丙沙星-BSA和兔抗鸭抗人IgG抗体的ELISA板内，反应一定时间，洗板去除未结合物质。
4、检测抗体添加
添加环丙沙星单克隆抗体，使其与板上残余的环丙沙星结合，并且检测样品中残余环丙沙星的含量。
5、加入酶标记抗体
将HRP标记的抗小鼠IgG二抗加入板中，反应30分钟洗板。
6、底物反应
加入TMB底物后在适当的时间内将酶底物进行反应，并停止反应。
7、颜色变化
将板子放在光度计上检测颜色反应值，计算样品中环丙沙星的含量。
三、结果和展望
本研究成功地制备了环丙沙星单克隆抗体和建立了ELISA检测方法，该方法具有灵敏度高、重复性好、分析时间短、操作简单、检测范围广等优点。然而，该方法的检测结果仍需要经过复杂的确认和验证，并需要与其他检测方法进行比较，以进一步验证其可靠性和稳定性。同时，需要进一步研究环丙沙星的毒性和其在环境中的迁移、转化和降解机理，为全面了解和控制环丙沙星的污染提供支持。