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药用植物基因组DNA提取及铁皮石斛RAPD反应体系的优化
引言
药用植物基因组研究是近年来的热点之一，其旨在解析药用植物的遗传信息，挖掘植物资源中的药用基因，为药物的研发和创制提供依据，同时也为植物遗传保护提供了科学依据。基因组研究的前提是成功地提取出药用植物的DNA。本文以铁皮石斛为例，探讨了药用植物基因组DNA提取和RAPD反应体系的优化。
材料与方法
材料
铁皮石斛叶片（新鲜或干燥）；2%CTAB提取液（含1%PVP）；75%酒精；3molL-1NaCl；10%聚乙二醇6000；6×染料溶液；TaqDNA聚合酶；随意引物。
方法
1.铁皮石斛基因组DNA的提取
将从铁皮石斛中取出的叶片加入液氮中冷冻，然后磨碎成粉末，加入2%CTAB提取液（含1%PVP）中，混合均匀后水浴加热至65℃，同时反复翻动试管，使组织完全裂解。接着添加等体积的氯仿并混合，离心5000r/min离心10min后可分离出两相。取上层液体加入10%聚乙二醇6000和6molL-1NaCl，混合均匀后静置于4℃冰箱中20min，离心12000r/min，除去上清液，用75%酒精进行全程清洗可获得纯净的DNA。
2.RAPD反应优化
RAPD反应样品的配置以25μL为一组，分别包括DNA模板1μL、dNTPs0.5mM、引物10pM、10×TaqDNA聚合酶缓冲液2.5μL、MgCl21.5mM、TaqDNA聚合酶0.5U、H2O至25μL。PCR反应分为以下步骤：
前变性：95℃3min；
变性：94℃30s；
退火：40℃30s；
延伸：72℃1min；
回到第二步进行30-40轮扩增；
最后72℃延伸7min；
反应结束后，将PCR产物随机挑选10条进行电泳分析。
结果
1.铁皮石斛基因组DNA的提取
图1铁皮石斛基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
2.RAPD反应优化
表1引物序列和长度
引物序列长度
1GACCGCTTGA10
2ACGCACACTG10
3CGGCTTGACC10
4CACGTCCCGT10
5GCTCGGTGTG10
图2不同引物对铁皮石斛RAPD反应的影响
结论
1.铁皮石斛基因组DNA的提取
本实验成功地从铁皮石斛中提取出了高质量、高纯度的基因组DNA，并经过琼脂糖凝胶电泳分析，确认获得了完整、未破损的DNA。
2.RAPD反应优化
经对不同引物对铁皮石斛RAPD反应的影响进行比较，确定了最优引物序列，并在优化后的反应体系中成功地扩增出的具有多态性的RAPD标记。
本实验提供了一种铁皮石斛基因组DNA提取和RAPD反应体系的优化方法，为药用植物基因组研究提供了参考。