绵羊骨髓抗菌肽（SMAP-29）在毕赤酵母中表达的研究.docx

绵羊骨髓抗菌肽（SMAP-29）在毕赤酵母中表达的研究
绵羊骨髓抗菌肽（SMAP-29）在毕赤酵母中表达的研究
摘要：
本研究旨在构建一个能够高效表达绵羊骨髓抗菌肽（SMAP-29）的毕赤酵母表达系统，并测试表达的SMAP-29的抗菌性能。首先，我们通过PCR从绵羊骨髓中提取到SMAP-29的cDNA，将其插入到毕赤酵母基因组中的表达载体pYES-DEST52中。然后，在含有SMAP-29的毕赤酵母中观察到了高表达水平和高分泌水平的SMAP-29，且其具有一定的抗菌活性。进一步的实验表明，在添加不同浓度的SMAP-29后，其可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。因此，这个毕赤酵母表达系统是一个有效的SMAP-29表达平台，并且所表达的SMAP-29能够具有良好的抗菌活性。
引言：
抗生素抗性越来越成为全球性的健康问题之一。随着广泛使用抗生素和滥用抗生素的增加，越来越多的微生物变得对抗生素具有越来越强的耐性。这就需要研究人员探索新的方法和新的抗生物质来抗击大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等越来越强的细菌。
SMAP-29是一种来自绵羊骨髓的抗菌肽，具有良好的抑制广谱菌和革兰氏阳性菌的能力。由于其天然存在的抗菌特性，SMAP-29被越来越多的研究者关注。
然而，这也需要一个高效的表达平台来将SMAP-29大规模生产出来。毕赤酵母表达系统是一种广泛应用的生物技术，其具有高效表达、易于操作和纯化等优点。
本研究旨在利用毕赤酵母表达系统产生高效表达的SMAP-29，同时测试其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗生活性。
实验方法:
1.从绵羊骨髓中提取RNA和cDNA:
由于SMAP-29是一个小分子肽，在骨髓中的表达水平很低，所以我们需要提取RNA和cDNA，进行反转录PCR来扩增SMAP-29的片段。
2.扩增SMAP-29片段并插入pYES-DEST52表达载体:
使用PCR扩增SMAP-29的编码序列，同时使用pYES-DEST52作为载体。利用PCR方法，在SMAP-29编码序列前端加入CACC序列，使扩增的SMAP-29片段能够插入pYES-DEST52载体。将扩增的片段与载体进行重组，并通过转化选择得到含有SMAP-29的毕赤酵母。
3.观察SMAP-29在毕赤酵母中的表达及分泌水平：
通过西方印迹法和酒精显色法观察SMAP-29在毕赤酵母中的表达及分泌水平，同时进行酶标技术测量SMAP-29抗菌活性。
结果：
从绵羊骨髓中成功提取到了SMAP-29的cDNA，并与毕赤酵母基因组中的表达载体pYES-DEST52重组，获得了含有SMAP-29的毕赤酵母。进一步的实验表明，该表达系统可以得到高表达水平和高分泌水平的SMAP-29，并且所表达的SMAP-29具有良好的抗菌活性。
在添加不同浓度的SMAP-29后，其可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。同时，Westernblot和酒精显色实验结果也表明SMAP-29被表达及分泌在毕赤酵母中。这个结果符合预期，当SMAP-29被表达出来后，其会分泌到培养基中，从而使培养基获得较好的抗菌效果。
结论：
本研究成功构建了一个高效表达SMAP-29的毕赤酵母表达系统，同时发现所表达的SMAP-29具有良好的抗菌活性。这个方法是一种新的、简单易行的表达SMAP-29和获得抗菌活性肽的方法。这个系统不仅有望为SMAP-29生产提供新的思路，也为其他肽类生产提供了一个有效的表达平台。
参考文献：
1.BoucherHW,TalbotGH,BenjaminDK,etal.(2013).10×'20progress—developmentofnewdrugsactiveagainstgram-negativebacilli:anupdatefromtheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica.ClinInfectDis,56(12),1685-1694.
2.Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,&Sambrook,J.(1982).Molecularcloning:alaboratorymanual.ColdSpringHarborlaboratorypress.
3.HarfordC,DavisRJ,AmayaK,etal.(2013).BactericidalActivityoftheNaturalPeptideSMAP-29.FEMSMicrobiolLett,340(1),32-37.