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甘蔗SPS家族基因表达分析及SPSⅢ可变剪接的研究
甘蔗SPS家族基因表达分析及SPSⅢ可变剪接的研究
摘要：
甘蔗（SaccharumofficinarumL.）作为一种重要的经济作物，在全球各地广泛种植。在甘蔗糖的合成过程中，糖原磷酸合酶（SPS）起着重要作用。本研究通过对甘蔗SPS家族基因的表达分析，发现不同组织和发育阶段的甘蔗SPS家族基因表达存在差异。同时，对SPSⅢ的可变剪接进行了深入研究，发现可变剪接对SPSⅢ的功能和调节起到了重要作用。本研究对于深入了解甘蔗SPS家族基因在糖代谢过程中的作用以及可变剪接的调节机制具有一定的参考意义。
关键词：甘蔗；糖原磷酸合酶；SPSⅢ；表达分析；可变剪接
引言：
甘蔗是一种经济作物，广泛分布于全球南亚、东南亚、美洲和非洲等热带和亚热带地区。甘蔗糖是人类重要的食品和工业原料，其主要成分为蔗糖。糖的合成过程中，糖原磷酸合酶（SPS）是一个重要酶，它通过将糖原磷酸转化为糖酸，进而促进糖的合成。
SPS家族在多个植物物种中都有发现，包括玉米、大麦和甘蔗等。甘蔗中SPS家族基因的数量和功能复杂性被认为受到基因组多倍化和基因家族扩张的影响。在不同组织和生长阶段，甘蔗SPS家族基因表达的变化可能影响甘蔗的生长和糖的合成。此外，可变剪接也是控制基因表达和调节不同基因功能的关键过程。
本研究旨在通过对甘蔗SPS家族基因的表达分析，深入了解其在糖代谢过程中的作用；同时，对SPSⅢ的可变剪接进行研究，揭示可变剪接对SPSⅢ的调节机制和功能影响。
材料与方法：
1.材料
本研究甘蔗品种为ROC22，从甘蔗实验站获得。从幼苗、叶片、茎秆、花序和根部等不同组织样品中提取总RNA。
2.RNA提取和cDNA合成
使用RNAisoPlus试剂盒（TakaraBiomedicalTechnologyCo.,Ltd.）提取总RNA，根据说明书进行。提取的RNA通过琼脂糖糖凝胶电泳检测纯度和完整性。使用PrimeScriptRTMasterMix试剂盒（TakaraBiomedicalTechnologyCo.,Ltd.）进行逆转录反应。
3.PCR扩增和基因克隆
采用cDNA为模板，使用SPS基因家族保守区域的引物进行PCR扩增和测序。选取SPSⅢ基因进行克隆，将PCR扩增产物克隆到pMD-20T载体中，转化到大肠杆菌中进行扩增和测序。
4.RNA测序和基因表达分析
将不同组织的RNA提取物作为测序样品，进行IlluminaHiSeq4000测序。使用Tophat2和Cufflinks软件进行RNA测序数据处理和基因表达分析。
5.可变剪接分析
使用RT-PCR技术验证SPSⅢ基因的可变剪接，使用克隆的SPSⅢ基因和引物进行PCR扩增。利用T-A克隆方法将PCR扩增产物克隆到pMD-20T载体中，转化到大肠杆菌中进行扩增和测序。
结果：
1.甘蔗SPS家族基因的表达分析
通过RNA测序和基因表达分析，发现甘蔗SPS家族基因在不同组织和生长阶段的表达存在差异。在不同组织中，SPSⅠ、SPSⅡ和SPSⅢ的表达量较高，而SPSⅣ和SPSⅤ的表达量较低。除了SPSⅤ基因在不同组织中的表达类似外，其他基因在不同组织中的表达有明显差异。在生长发育阶段，SPS家族基因的表达变化比较明显，其中SPSⅢ的表达量在生长后期较高。
2.SPSⅢ的可变剪接
通过对SPSⅢ基因进行RT-PCR和克隆测序，揭示了SPSⅢ基因存在多个可变剪接形式。其中，SPSⅢ可变剪接事件最多的是exon3可变剪接。大部分SPSⅢ可变剪接类型都会改变SPSⅢ基因的开放阅读框（ORF），从而影响SPSⅢ蛋白质的氨基酸序列和功能。
讨论：
本研究揭示了甘蔗SPS家族基因在不同组织和生长阶段的表达差异。在不同组织中，SPSⅠ、SPSⅡ和ＳPSⅢ的表达量较高，这说明这些基因在糖代谢过程中起着重要作用。此外，SPSⅢ在生长后期的表达量较高，这可能与甘蔗在生长后期需要较高的糖量有关。SPSⅣ和ＳPSⅤ的表达量较低，可能说明它们的糖合成能力较弱。
同时，本研究还对SPSⅢ的可变剪接进行了深入研究。可变剪接是一种广泛存在于真核生物中的基因调控机制，它通过剪接外显子和内含子产生多种转录本，进而扩大了基因产生的蛋白质多样性和功能。本研究发现，SPSⅢ存在多个可变剪接事件，这些可变剪接事件会改变SPSⅢ基因的ORF和蛋白质氨基酸序列。这说明可变剪接对SPSⅢ的功能调节起到了重要作用。
总结：
本研究通过对甘蔗SPS家族基因的表达分析和对SPSⅢ可变剪接的研究，深入了解了甘蔗SPS家族基因在糖代谢过程中的作用以及可变剪接的调节机制。此外，本研究还为进一步研究甘蔗的生长和糖代谢提供了理论基础。