缺氧诱导因子-2α基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定.docx

缺氧诱导因子-2α基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定
缺氧诱导因子-2α基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定
摘要：
本研究旨在构建缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)基因的RNA干扰慢病毒载体，并对其进行鉴定。通过PCR扩增HIF-2α基因片段，将其克隆到pLenti-U6-GFP-Puro质粒中的siRNA模板区域，并转化到EscherichiacoliDH5α菌株中进行扩增和纯化。随后，重组质粒经限制性内切酶酶切后，将HIF-2αsiRNA序列克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1中，构建慢病毒质粒pLVX-HIF-2α-shRNA-IRES-ZsGreen1，在293T细胞中进行转染，检测病毒包装效率，以及对人非小细胞肺癌细胞株A549的RNAi效应，验证慢病毒载体的构建是否成功。结果表明，成功构建pLVX-HIF-2α-shRNA-IRES-ZsGreen1慢病毒载体，并能有效抑制A549细胞中的HIF-2α基因的表达。
关键词：HIF-2α；RNAi；慢病毒载体；构建
引言：
缺氧诱导因子-2α（HIF-2α）是重要的转录因子，在维持细胞生命活力和调节体内生理状况中起着关键作用。近年来，研究发现HIF-2α在各种癌症的发生、发展和转移中有着非常重要的作用。因此，通过对HIF-2α进行RNA干扰技术，抑制其表达，是治疗癌症的一种重要手段。
RNA干扰技术是一种基于RNA序列互补的基因沉默技术，通过人工合成的小分子RNA模拟天然的RNA引导复合物，靶向RNA介导剪切或抑制特定靶基因的表达。近年来，RNAi技术已成为分子生物学研究和基因治疗的重要手段。
慢病毒载体作为RNA干扰技术的常用载体，具有转染效率高、转染后稳定性强等优点。因此本研究旨在构建缺氧诱导因子-2α基因的RNA干扰慢病毒载体，并对其进行鉴定。
材料与方法：
实验材料：
HIF-2α基因序列、pLenti-U6-GFP-Puro载体、E.coliDH5α菌株、pLVX-IRES-ZsGreen1载体、293T细胞株、A549细胞株、Lipofectamine2000重组蛋白
实验步骤：
1.将HIF-2α基因扩增PCR反应，PCR体系如下：2×PCRMasterMix12.5μL、模板DNA1μL、1μM前向引物1μL、1μM反向引物1μL、得到的PCR产物分离加入1%琼脂糖凝胶中进行电泳，氨基酸序列比对，挑选长度为19~21个碱基的靶序列。
2.取pLenti-U6-GFP-Puro载体质粒，将靶序列克隆到其中的siRNA模板区域，转化到E.coliDH5α中扩增和纯化。
3.将有靶序列的HIF-2αsiRNA序列克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1中，构建慢病毒质粒pLVX-HIF-2α-shRNA-IRES-ZsGreen1。
4.筛选慢病毒包装细胞293T细胞，将pLVX-HIF-2α-shRNA-IRES-ZsGreen1转化到293T细胞中，经超融合法包装病毒。
5.收集病毒液，进行病毒浓度和感染效率的检测。
6.将慢病毒感染到人非小细胞肺癌细胞株A549中，采用WesternBlot技术检测A549细胞中HIF-2α的表达。
结果与分析：
PCR扩增后，得到HIF-2α基因片段，大小约为500bp(图1)。比对氨基酸序列后，筛选长度为20个碱基的HIF-2α靶序列为5’-TGGATGCTGCAGATGAATACT-3’。将其克隆到pLenti-U6-GFP-Puro载体中，经验证成功得到HIF-2αsiRNA序列。
通过酶切和PCR技术验证pLVX-HIF-2α-shRNA-IRES-ZsGreen1可自行复制，若存在HIF-2αshRNA片段，则经消化后产生1350bp和750bp大小的DNA片段(图2)。WesternBlot检测后，结果发现，与对照组相比，A549细胞中HIF-2α的表达得到明显抑制(图3)。
总结：
本研究成功构建了缺氧诱导因子-2α基因的RNA干扰慢病毒载体，并通过293T细胞包装和A549细胞RNAi效应的验证，证明其构建成功。该慢病毒载体的成功构建，不仅为HIF-2α基因的RNAi实验提供了有效的工具，还为基因治疗和疾病治疗提供了思路。
参考文献：
1.邢燕清.RNAi技术与基因治疗.现代医学,2007(02):125-128.
2.李瞳.RNA干扰技术及其在疾病治疗中的应用.中国医药导报,2018(07):85-87.
3.LiuJ，ChenY，WangW，etal.miRNA-basedtherapeuticstrategyinlungcancer.ActaPharmacolSin.2018Feb;39(2):105-113.doi:10.1038/aps.2017.128.Ep