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葡萄病毒AMP基因RNA干扰载体的构建及其鉴定
摘要：葡萄病毒（GrapevinevirusA，GVA）是一种较为普遍的葡萄科植物病毒，它对葡萄的生长和发育具有严重影响。本研究通过构建RNA干扰载体，成功实现了对GVAMP基因的RNA干扰，并通过RT-PCR、Westernblot和ELISA等方法对RNA干扰效果进行了验证。实验结果表明，RNA干扰载体能够显著降低GVA感染下葡萄细胞中MP基因的表达，从而达到抑制病毒复制的目的。本研究为探究GVA的致病机制以及培育抗病葡萄品种奠定了基础。
关键词：葡萄病毒A；MP基因；RNA干扰；载体构建；RNA干扰效果
引言：
葡萄病毒A（GrapevinevirusA，GVA）是一种较为普遍的葡萄科植物病毒，常见于世界各地的葡萄园中，它对葡萄的生长和发育具有严重影响，导致产量和品质降低，为葡萄产业和生态产业带来了很大的损失。目前，防治GVA的方法主要是使用化学农药，但是这种方法对环境和人体健康都有较大的危害，因此，探究其致病机制并寻找新的防治方法具有重要意义。
RNA干扰技术是一种近年来广泛应用于基因功能研究和基因治疗的技术，它能够通过基因靶向沉默或抑制，达到阻断目标基因表达的目的。RNA干扰技术广泛应用于植物病毒的研究中，通过RNA干扰技术沉默病毒基因，从而抑制病毒的复制和感染，成为新的防治方法。
本研究着眼于GVA的MP基因，构建了RNA干扰载体pYBA-fMP-GFP，利用农杆菌介导的转化技术将其转化到叶片上，并通过一系列实验验证了其RNA干扰效果，为探究GVA的致病机制以及探索新的防治方法奠定了基础。
材料与方法：
1.构建RNA干扰载体
通过PCR扩增葡萄GVAMP基因，然后将库存的pYBA2309载体进行限制性酶切，与GVAMP基因PCR产物连接，构建pYBA-fMP-GFP载体，将其转化至E.coliDH5α中，然后进行片段测序和限制性酶切验证，构建成功的载体转化至农杆菌EHA105中，待用。
2.农杆菌介导的转化
取GVA病毒感染下的葡萄叶片，通过细菌素和硅胶的方法提取基因座并获取细胞内质粒DNA，将其质粒DNA与pYBA-fMP-GFP载体进行重组，得到重组质粒，将重组质粒转接至农杆菌EHA105中，通过叶片注射或浸泡的方法转化GVA感染下的葡萄叶片。
3.RT-PCR分析
取转化后的葡萄叶片，通过RNA提取试剂盒提取总RNA，然后进行cDNA合成，使用融合引物扩增MP基因序列，同时扩增β-actin序列作为内参照。PCR程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。通过电泳法检测PCR产物，计算其相对表达量。
4.Westernblot分析
取转化后的葡萄叶片，通过组织研磨液将其打碎，然后进行蛋白质提取，使用10%SDS-PAGE凝胶电泳，将电泳后的蛋白质转移至PVDF膜上，用抗GFP抗体和抗β-actin抗体进行检测。
5.ELISA检测
通过ELISA法检测转化后葡萄叶片中的GVA含量，将葡萄叶片放入96孔板中，加入GVA抗体和HRP标记二抗，最后进行OD值的测定，进行GVA含量的计算。
结果：
1.成功构建pYBA-fMP-GFP载体
通过PCR扩增GVAMP基因，然后与pYBA2309载体连接，构建pYBA-fMP-GFP载体，将其转入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌LBA4404-pYBA-fMP-GFP，表达目标基因已成功构建。
2.成功转化GVA感染下的葡萄叶片
将重组农杆菌LBA4404-pYBA-fMP-GFP转化至GVA感染下的葡萄叶片中，可以明显看到叶片的绿色荧光表现。
3.RNA干扰载体可显著降低GVA感染下葡萄细胞中MP基因的表达
转化后的葡萄叶片中，MP基因与β-actin基因分别被扩增，相对表达量可计算，结果表明，RNA干扰载体能够显著降低GVA感染下葡萄细胞中MP基因的表达，RNA干扰效果显著。
4.RNA干扰载体对GVA复制有一定的抑制作用
通过检测转化后葡萄叶片的GVA含量，结果显示RNA干扰载体有一定的抑制作用，能够降低病毒复制的效率。
5.RNA干扰载体的表达是否稳定
通过Westernblot检测重组农杆菌LBA4404-pYBA-fMP-GFP在植物细胞中的表达情况，结果表明，载体的表达是稳定的。
结论：
通过构建RNA干扰载体pYBA-fMP-GFP，通过转化方法将其引入到GVA感染下的葡萄叶片中，成功实现了对GVAMP基因的RNA干扰，通过一系列实验验证了RNA干扰效果。RNA干扰载体能够显著降低GVA感染下葡萄细胞中MP基因的表达，从而达到抑制病毒复制的目的。本研究为探究GVA的致病机制以及培育抗病葡萄品种奠定了基础，也为研究RNA干扰技术在植物病毒防治中的应用提