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携带Akt1基因慢病毒载体构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达
携带Akt1基因慢病毒载体构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达
引言
干细胞治疗是一种新兴的治疗方法，其已被广泛用于各种疾病的治疗。骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）是一种常用的干细胞，可以自我更新和不断分化为多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。在骨科和牙科应用中，BM-MSCs已被证明可以促进骨再生和软骨再生。然而，随着对干细胞研究的深入，人们发现BM-MSCs存在一些局限性和挑战性，例如BM-MSCs自我更新能力有限、体外扩增难度大等。因此，将遗传信息转导到BM-MSCs中，使其获得更好的生长和分化能力，是一个具有吸引力的研究方向。Akt1是一个蛋白激酶，参与细胞增殖和分化等生命活动，与骨代谢密切相关。因此，将Akt1基因转导到BM-MSCs中，有望提高其生长和分化能力。本文旨在构建可携带Akt1基因的慢病毒载体，并利用该载体在人BM-MSCs中成功表达Akt1基因的方法，为其在骨科和牙科应用中提供技术基础。
方法
1.构建pLenti-CMV-Akt1-GFP慢病毒载体
首先，我们将人Akt1基因的cDNA克隆到pLenti-CMV-GFP-Puro慢病毒载体的多克隆位点上。接下来，使用PCR扩增人Akt1基因，并在扩增产物末端加入NheI和MluI的限制酶切位点。将PCR产物和慢病毒载体进行双酶切，并进行质粒构建。最后，进行质粒酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA测序等验证构建结果。成功构建出pLenti-CMV-Akt1-GFP慢病毒载体。
2.准备BM-MSCs
收集志愿者的骨髓组织，进行离心分离获得BM-MSCs。将获得的BM-MSCs放置于flask中，在DMEM/F12培养基中培养。当细胞生长到80%时，进行传代培养，直至获得足够数量的BM-MSCs。
3.表达Akt1基因
使用pLenti-CMV-Akt1-GFP慢病毒载体对BM-MSCs进行转染。将2ml的病毒载体加入5ml细胞培养液中，使其含病毒载体最终稀释为MOI=10。将混合液加入细胞培养皿中，进行转染。48小时后，加入筛选抗生素(asauxotrophicselectionmarker)进行筛选，以便检索Akt1-GFP稳定的表达细胞株。
4.Westernblotting
使用Westernblotting方法检测BM-MSCs中Akt1-GFP的蛋白表达。将获得的BM-MSCs细胞溶于RIPA缓冲液中，并运用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分子进行分离。将蛋白质转移到聚酰胺酰胺膜上，施加精细定量抗体，使用激光扫描系统观测荧光，通过定量标准曲线算出蛋白质分子的数量。
结果
成功构建出pLenti-CMV-Akt1-GFP慢病毒载体。使用该载体对BM-MSCs进行转染，成功表达Akt1基因，并通过Westernblotting方法表明所转录的Akt1表达在蛋白质水平上得到了提高。
讨论
BM-MSCs是骨再生和软骨再生的重要来源。使用慢病毒载体表达Akt1基因，可以提高BM-MSCs的生长和分化能力，从而增强其在骨代谢中的应用前景。通过本研究，成功构建了可携带Akt1基因的慢病毒载体，并在BM-MSCs中成功表达Akt1基因。这为其在骨科和牙科应用中提供了技术基础。下一步，我们将进一步深入研究其在骨代谢中的应用。
结论
本研究成功构建了可携带Akt1基因的慢病毒载体，并利用该载体在人BM-MSCs中成功表达Akt1基因。这为其在骨科和牙科应用中提供了技术基础。未来，我们将继续深入探究其在不同类型干细胞中的表达和调控机制，以期在临床上实现更好的应用效果。