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慢病毒VEGF165载体的构建及其在骨骼间充质干细胞中的表达
慢病毒VEGF165载体的构建及其在骨骼间充质干细胞中的表达
摘要
骨骼间充质干细胞（BMSCs）在组织修复和再生方面具有重要作用。VEGF165是一种天然存在的血管生成素，对血管生成和组织修复有促进作用。本文利用慢病毒载体构建了VEGF165的表达载体，并将其转导到BMSCs中，验证了其表达和功能。
【关键词】慢病毒载体，VEGF165，骨骼间充质干细胞
引言
BMSCs具有自我更新和多向分化的能力，在组织修复和再生方面具有广泛应用前景。VEGF165是一种天然存在的血管生成素，对血管生成和组织修复有促进作用。通过慢病毒载体，可实现外源基因的表达和转导，从而研究其在基因治疗方面的应用。本文旨在构建VEGF165的表达载体，并将其转导到BMSCs中，验证其表达和功能。
材料与方法
1.慢病毒载体的构建
在pcDNA3.1(+)载体中克隆VEGF165基因序列，并用PCR方法扩增得到VEFG165基因序列。将PCR产物引入慢病毒载体pLenti-CMV-ires-GFP-T2A-blasticidin中，通过酶切和连接技术，得到含有VEFG165基因的表达载体。
2.BMSCs的培养和转染
收集新鲜的小鼠骨髓，将骨髓细胞粘附于培养皿底部，进一步培养得到BMSCs。在BMSCs早期培养条件下，负责进行慢病毒载体的转染。采用FuGeneHD转染试剂将载体和包装质粒共同转染到BMSCs中。
3.RT-PCR和WesternBlot分析
分别在转染后第1、3、5天，提取总RNA并引入RT-PCR进行实时PCR实验，分析VEGF165基因在BMSCs中的表达情况。Westernblot是常用的蛋白质检测技术，利用抗体识别靶蛋白，从而得到靶蛋白的表达及其在各处理组织中的相对量。
结果
1.成功构建含有VEGF165基因的慢病毒载体。
2.成功将慢病毒载体转染到BMSCs中，实时PCR和Westernblot分析表明，VEGF165在转染后的BMSCs中得到了高效表达，且表达随时间的延长而逐渐增强。
讨论
VEGF165是一种天然存在的血管生成素，对血管生成和组织修复有促进作用。通过慢病毒载体的转导，VEGF165基因能够在BMSCs中进行高效表达。本文结果表明，VEGF165的表达在转染后随时间的延长而逐渐增强，说明慢病毒载体的外源基因在BMSCs中具有较高的稳定性和可持续性表达。本文结果提供了慢病毒载体在基因治疗方面的应用前景，并为进一步探究VEGF165对BMSCs分化和修复效应的作用提供了基础研究。
结论
在本研究中，成功构建了含有VEGF165基因的慢病毒载体，并将其转染成功到BMSCs中。实时PCR和Westernblot分析结果表明，VEGF165在转染后的BMSCs中得到了高效表达，且表达随时间的延长而逐渐增强。这些结果为慢病毒载体在基因治疗方面的应用提供了前景，并为进一步探究VEGF165对BMSCs分化和修复效应的作用提供了基础研究。