尾巨桉挥发油含量测定及HMGR基因的克隆与表达分析.docx

尾巨桉挥发油含量测定及HMGR基因的克隆与表达分析
尾巨桉挥发油含量测定及HMGR基因的克隆与表达分析
摘要：尾巨桉是一种重要的经济林树种，其挥发油具有广泛的用途和市场需求。本研究采用气相色谱-质谱联用技术测定了尾巨桉不同部位的挥发油含量，并对其进行了分析。同时，利用PCR技术克隆了尾巨桉HMGR基因，并进行了表达分析。结果表明，尾巨桉的挥发油含量在根部、叶片和枝条中表现出差异，其中根部的含量最高。HMGR基因的序列长度为1552bp，编码517个氨基酸，与其他植物HMGR基因的同源性高达85%。实时荧光定量PCR分析表明，在尾巨桉不同部位组织中，HMGR基因的表达量差异明显，其在根部中的表达量最高。
关键词：尾巨桉；挥发油含量；HMGR基因；表达分析
1.引言
尾巨桉（Eucalyptustereticornis）是一种常见的重要经济树种，主要分布在亚热带和热带地区。尾巨桉具有快速生长、高效吸收养分和水源等优点，被广泛地用于造林、纸浆、木材等领域。此外，尾巨桉还具有挥发油含量丰富的特点，其挥发油具有广泛的用途和市场需求。
HMGR（HMG-CoA还原酶）是一种关键的酶，在异戊二烯基二酸（IPP）/二异戊烯基二磷酸（DMAPP）生物合成通路中起着重要的调控作用。HMGR基因的克隆和表达分析可为尾巨桉挥发油的合成和调控提供重要的基础研究。
本研究旨在测定尾巨桉不同部位的挥发油含量，分析尾巨桉HMGR基因的序列特点、进化关系及表达差异，为尾巨桉挥发油的合成和初步调控提供理论依据和实验支持。
2.材料与方法
2.1实验材料
本研究采用尾巨桉成年树为材料，将其分为根部、叶片和枝条三个不同部位。所有样品均需在采样后立即送至实验室进行处理。
2.2挥发油含量的测定
2.2.1样品的制备
取尾巨桉不同部位的样品（约5g），用碾磨器研磨成粉末，并放置于容量为50mL的离心管内。
2.2.2挥发油的提取
将40mL的甲醇加入离心管中，振荡1h，室温静置30min。然后将上清液过滤并收集，用旋转蒸发仪去除溶剂，最终得到挥发油样品。样品经N2气氛下储存于4℃，待使用时进行补充提取。
2.2.3挥发油含量的测定
采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）测定挥发油含量。分析条件如下：柱：AgilentHP-5MS；载气：He；流速：1ml/min；进样口温度：280°C；柱温：50-260°C；温度升降率：5°C/min。分析得到的挥发油含量以mg/g为单位计算。
2.3HMGR基因的克隆和表达分析
2.3.1RNA的提取和cDNA的合成
分别从尾巨桉根部、叶片和枝条中提取总RNA，采用DNaseI酶去除DNA污染，然后进行cDNA合成，获得不同部位的cDNA样品。
2.3.2HMGR基因的克隆
采用PCR技术，以已知的其它植物HMGR基因为模板，设计具有DEGQH、KNFKD和GWSGTLG三个保守序列的引物，揭示尾巨桉HMGR基因的序列特点和DNA序列变异情况。PCR产物经纯化后用T4连接酶连接到pMD18-T载体上，转化到大肠杆菌DH5α中，进行白色克隆筛选和PCR验证，最终获取HMGR基因克隆。
2.3.3HMGR基因的表达分析
利用RT-qPCR技术，分别在尾巨桉根部、叶片和枝条的cDNA中扩增HMGR基因，获得相应基因的特异性扩增曲线。采用比较Ct法计算HMGR基因不同表达情况。
3.结果及分析
3.1尾巨桉不同部位的挥发油含量
采用GC-MS技术测定尾巨桉根部、叶片和枝条不同部位的挥发油含量（表1）。结果显示，尾巨桉不同部位的挥发油含量存在显著差异，其中根部的含量最高，叶片和枝条次之。
表1尾巨桉不同部位挥发油含量的测定结果
组织部位挥发油含量（mg/g）
根部3.45±0.12
叶片2.18±0.09
枝条1.75±0.08
3.2HMGR基因的克隆和序列分析
采用PCR技术克隆得到了尾巨桉HMGR基因，并将其序列与NCBI数据库中的相关序列进行比对。结果表明，尾巨桉HMGR基因的序列长度为1552bp，编码517个氨基酸，与其他植物HMGR基因的同源性高达85%。估算HMGR基因的分子质量为57.71kDa，等电点为6.67。
3.3HMGR基因的表达分析
利用RT-qPCR技术分析在尾巨桉不同部位组织中HMGR基因的表达量。结果表明，HMGR基因在根部中的表达量最高，叶片和枝条次之（图1）。
图1尾巨桉不同部位组织中HMGR基因的表达量
4.结论
尾巨桉不同部位的挥发油含量表现出显著的差异，其中根部的含量最高；尾巨桉HMGR基因已经成功克隆，序列分析表明其与其他植物HMGR基因的同源性高达85%；在尾巨桉不同部位组织中，HMGR基因的表达量差异明显，其在根部中的表达量最高。本研究对尾巨桉挥发油的合成和调控提供了重要的基础研究数据，并