基于实时荧光定量PCR的浸矿微生物群落结构分析的方法研究.docx

基于实时荧光定量PCR的浸矿微生物群落结构分析的方法研究
引言
浸矿微生物群落结构研究对于深入了解浸矿过程中微生物的作用、优化浸矿条件、提高浸矿效果有着重要意义。实时荧光定量PCR技术作为一种高灵敏度、高特异性、高通量分析技术，可以在短时间内得到精确的微生物DNA定量结果，因此被广泛应用于浸矿微生物群落结构的研究中。本文将就此进行详细的介绍。
实验材料与方法
1.实验材料
本研究选取一种常见的浸矿细菌——黄铜绿假单胞菌(Acidithiobacillusferrooxidans)的DNA进行实验。DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、荧光定量PCR仪、热循环仪等实验设备均为常用仪器。
2.实验方法
2.1浸矿细菌DNA提取
为了获取标本，我们挑选浸泡于含有黄铜绿假单胞菌(Acidithiobacillusferrooxidans)的浸矿液中的样品。首先，提取细菌DNA，我们使用了普遍惯用的酚/氯仿法（PaerataandTurnbull2004;Wilson1987），其主要步骤如下：首先，将500μL菌液经3000rpm离心10min。三重冷冻法作为细胞破碎的手段，在-80°C冷藏器先后地冻结和解冻菌液，三次循环。接着，加入100μL20%SDS、10μL蛋白酶K，以及500μLPhenol/Chloroform/IsoamylAlcohol，4000rpm离心10min，取上清液（400μL）。加入400μL氯仿-异戊醇之后，4000rpm离心10min，取上清液（250μL）。加入等体积的冰冷99%酒精，冷冻后离心。下覆液以去离子水冲洗，干燥之后加入TrisEDTA缓冲液使其重溶，即得到浸矿细菌DNA。
2.2荧光定量PCR
我们使用荧光定量PCR技术进行DNA定量。PCR试剂盒的配方为：模板DNA1μL，前引物0.7μL，后引物0.7μL，SYBRGreen10μL，水7.6μL。模板DNA浓度为250ng/μL。从此，开始荧光实时PCR。
PCR工艺：依托热循环仪的“三段式放大”，以10μL荧光定量PCR试剂试剂为一样本，在FastQ96荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR试验。PCR反应条件分别为：首先，在95°C下预处理3min；
其次，在95°C下完全变性30s，60°C下有限度的重磅40s，72°C下拉伸聚合50s，重复40个循环；最后，进行72°C下伸长聚合10min。
2.3实验结果数据分析
我们通过荧光定量PCR技术得到了浸矿细菌(Acidithiobacillusferrooxidans)DNA的定量结果，进而对黄铜绿假单胞菌(Acidithiobacillusferrooxidans)在浸矿过程中的角色进行了详细的研究分析。
结果与讨论
浸矿微生物是浸矿过程中不可忽视的一个环节。荧光定量PCR技术能够在很短时间内得到微生物DNA定量结果。
本研究中，我们选择了一种常见的浸矿细菌——黄铜绿假单胞菌(Acidithiobacillusferrooxidans)进行实验，并采取了酚/氯仿法提取其DNA。经过PCR增幅以及荧光定量PCR分析，我们可以得到该浸矿细菌的DNA浓度结果。
进一步的，我们将研究重点放在浸矿微生物在浸矿过程中所扮演的角色上。以黄铜绿假单胞菌(Acidithiobacillusferrooxidans)为例，在浸矿过程中，该细菌具有很强的氧化性能力，可将矿石中的硫化物转变为硫酸盐，从而使得矿石中的金属离子溶解于浸出液中，进而提高了浸出效果。同时，该细菌也会将重金属化合物的毒性转化为难溶的硫化物，从而减少水体对金属的污染。
结论
本研究采用实时荧光定量PCR技术对浸矿微生物群落结构进行了分析。本实验结果证明该技术可用于在浸矿微生物研究中对细菌数量的高效定量。同时，黄铜绿假单胞菌(Acidithiobacillusferrooxidans)在浸矿过程中扮演着至关重要的角色，其氧化性能力能够促进矿石中金属的浸出，保护水体不受污染。这说明我们可以在实践中优化浸矿条件，从而更好地利用微生物群落来提高浸出效果。