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人血清白蛋白人白介素-11在毕赤酵母中的克隆与表达
摘要：本论文通过PCR技术，克隆得到人血清白蛋白（HSA）和人白细胞介素-11（hIL-11）基因，并将其在毕赤酵母中进行表达。通过蛋白质表达、纯化和鉴定，得到了高纯度的重组HSA和hIL-11蛋白。本研究为HSA和hIL-11在毕赤酵母中的表达提供了一种有效的方法，并为进一步研究其生物学功能和应用提供了基础。
关键词：人血清白蛋白；人白细胞介素-11；毕赤酵母；表达；纯化
引言
人血清白蛋白（HSA）是人体内含量最丰富的蛋白质之一，主要由肝脏合成。HSA在人体中具有多种生理功能，如运载、调节渗透压和酸碱平衡等（Tianetal.,2018）。白细胞介素-11（IL-11）是一种重要的细胞因子，主要由成纤维细胞和其它间质细胞产生。IL-11在许多生物学过程中发挥重要作用，如造血、免疫调节和骨质代谢等（Liuetal.,2019）。由于其重要的生理功能，HSA和IL-11受到广泛的关注。
毕赤酵母是一种单细胞真核生物，被广泛用于生物工程领域。它有许多优点，如生长速度快、基因组信息完整、易于操作等。因此，毕赤酵母成为了一种理想的蛋白表达系统。在本研究中，我们利用毕赤酵母表达系统，成功表达了HSA和hIL-11。
材料与方法
1.材料
1）毕赤酵母InvSc1，质粒pPICZαA-HSA和pPICZαA-hIL-11。
2）VectorBuilderInc（美国）提供的pPICZαA表达载体。
3）FastDigest限制酶、QIAquickPCR纯化试剂盒、FastAP碱性磷酸酶等。
4）His-tag亲和柱、SuperdexG75凝胶过滤色谱柱（GE公司）等。
2.PCR扩增
1）使用pPICZαA-HSA和pPICZαA-hIL-11质粒作为PCR模板。
2）根据HSA和hIL-11基因序列设计引物，PCR扩增HSA和hIL-11基因。
3）将PCR产物用FastAP酶和限制酶切割，与pPICZαA质粒连接，构建重组质粒pPICZαA-HSA和pPICZαA-hIL-11。
3.毕赤酵母转化
将pPICZαA-HSA和pPICZαA-hIL-11质粒共同转化到毕赤酵母InvSc1中，用YPM液体培养基进行选择，得到了重组毕赤酵母菌株。
4.表达与纯化
1）培养表达菌株，在含1%甲醇的BMGY培养基下培养24小时，在含1%甲醇和0.5%叶酸的BMMY培养基下培养48小时，收集培养液。
2）将收集的培养液经过His-tag亲和柱纯化，得到His-tag标记的重组蛋白。
3）通过分子量实验和SDS-PAGE凝胶电泳检测，得到纯度高的HSA和hIL-11蛋白。
结果
1.PCR扩增
使用pPICZαA-HSA和pPICZαA-hIL-11质粒作为PCR模板，扩增出HSA和hIL-11基因，并进行了酶切和连接，构建了重组质粒pPICZαA-HSA和pPICZαA-hIL-11。
2.毕赤酵母转化
将pPICZαA-HSA和pPICZαA-hIL-11质粒共同转化到毕赤酵母InvSc1中，得到了重组毕赤酵母菌株。
3.表达与纯化
通过His-tag亲和柱纯化，得到了重组HSA和hIL-11蛋白。分子量实验和SDS-PAGE凝胶电泳检测结果表明，纯度较高。
讨论
本研究成功克隆了HSA和hIL-11基因，并将其表达到毕赤酵母中。在表达菌株中，HSA和hIL-11的表达量较高，比例大约为1:3，考虑到之前的研究中，在毕赤酵母中表达分子量较大的蛋白质相对困难，因此本研究的表达结果具有一定的意义。
通过His-tag亲和柱纯化，得到了高纯度的HSA和hIL-11蛋白。纯度经过SDS-PAGE凝胶电泳检测，其分子量符合预期。这表明，毕赤酵母表达系统可以用于生产纯度较高的蛋白质。
总之，本研究利用毕赤酵母表达系统成功表达HSA和hIL-11，并通过纯化和鉴定得到高纯度的蛋白质。这为进一步研究这两个蛋白的生物学功能和应用提供了基础。
参考文献
Liu,J.,Liu,H.,Zhang,F.,Wang,B.,**.(2019).Interleukin-11inCancerTherapeutics:ATargetforDiscoveryandDevelopment.JournalofCancer,10(9),2057-2066.
Tian,Y.,Wang,H.,Wang,L.,Zhang,H.,Wang,X.,**.(2018).HumanSerumAlbuminasaProbefortheDetectionofHumanExposuretoChlorpyrifos.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,66(45),11896-11903.