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猪羧肽酶A1酶原的基因克隆及其在毕赤酵母中的表达
猪羧肽肽酶A1（carboxypeptidaseA1，CPA1）是一种重要的消化酶，在胰腺中广泛存在，能够催化蛋白质的C端肽键水解，将C端的氨基酸去除，是调节消化酶活性的重要因素。CPA1酶原是CPA1的前身，可在胰腺细胞中被合成，并在进入肠道后被降解成CPA1。CPA1和CPA1酶原的研究对于理解肠道消化和胰腺疾病的发生具有重要的意义。本研究旨在克隆猪CPA1酶原基因，将其表达在毕赤酵母中进行功能研究。
1.材料与方法
1.1实验材料
猪胰腺组织、毕赤酵母（Pichiapastoris）、pPIC9K载体、Escherichiacoli（E.coli）DH5α菌株、QiagenPlasmidMiniKit、QuickPCRCloningKit、QIAprepSpinMiniprepKit、BamHI、XhoI、agarose、蒸馏水等。
1.2克隆猪CPA1酶原基因
（1）RNA提取和cDNA合成
从猪胰腺组织中提取总RNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser合成cDNA。PCR扩增猪CPA1酶原基因的开放阅读框（ORF）时，使用以下引物：5’-ATGGCTGCGCAGTGGC-3’（前引物）和5’-TTAGTTTCCTTGGTGACTGCTGG-3’（后引物）。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，提取目的片段。
（2）基因克隆
将目的片段使用QuickPCRCloningKit连接至pUC19载体，转化至E.coliDH5α菌株中，进行纯化和测序。正确序列的pUC19-CPA1酶原表达质粒经双酶切，将CPA1酶原ORFDNA片段与pPIC9K载体连接，转化至E.coliDH5α菌株中，进行纯化和测序。
1.3毕赤酵母转化和表达
（1）线性化质粒
利用BamHI和XhoI酶切pPIC9K-CPA1酶原表达质粒，线性化质粒的线性DNA片段用于毕赤酵母表达质粒构建。
（2）毕赤酵母转化
将线性化的pPIC9K-CPA1酶原表达质粒转化至毕赤酵母中。在MD的复合培养基中进行初步筛选。选取阳性菌落进行复筛和PCR确认。
（3）确定表达条件
合适的诱导剂浓度和培养时间等因素对毕赤酵母的表达产量有很大影响。本实验中，具体诱导条件分别为不同甲醇浓度和培养时间。利用SDS-PAGE分析毕赤酵母的表达情况，并进行Westernblot检测。
2.结果与分析
2.1CPA1酶原基因克隆
利用总RNA从猪胰腺组织中提取出CPA1酶原基因ORF的cDNA。扩增得到了一个1668bp的DNA片段，其中包含CPA1酶原ORF的完整编码区域。通过PCR克隆和测序分析确认，结果显示克隆的CPA1酶原基因ORF序列与NCBI数据库中已经报道的猪CPA1酶原的序列完全一致。
2.2CPA1酶原表达
成功构建了表达猪CPA1酶原的毕赤酵母，通过Westernblot检测发现不同甲醇浓度和培养时间对其表达有显著影响。甲醇浓度为1%时，毕赤酵母表现出较高的表达和分泌产量。Westernblot结果表明，得到的目的蛋白主要以全长蛋白为主，并随着培养时间的增加而增加。表达蛋白的分子量符合理论预期。这表明此表达系统对于猪CPA1酶原的表达和分泌具有较好的适应性和表达效率。
3.结论
本研究成功克隆了猪CPA1酶原基因并将其表达在毕赤酵母中。Westernblot和SDS-PAGE结果表明，所表达的目的蛋白具有良好的纯度和活性，证明毕赤酵母是一种有效表达CPA1酶原的工具。本研究为进一步了解CPA1酶原在消化酶调控和疾病发生中的作用提供了一定的基础。