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Fank1基因敲减小鼠差异表达基因筛选及验证
摘要：
Fank1（Fanconianemia-associatednuclease1）是一种重要的核酸酶，具有维护基因组稳定性和参与细胞周期调控等功能。本研究利用CRISPR/Cas9技术将Fank1基因敲减小鼠构建成功，并通过转录组测序技术对敲减小鼠和野生型小鼠进行比较分析，筛选出一批差异表达基因。进一步验证发现，这些基因与生物过程、分子功能和细胞组分等遗传学和生理学过程相关。该研究为进一步探究Fank1基因在机体内的作用及其参与的生命活动提供了重要参考。
关键词：Fank1；基因敲减；小鼠；差异表达基因；生命活动
Abstract：
Fank1(Fanconianemia-associatednuclease1)isanimportantnucleicacidenzymewithfunctionsofmaintaininggenomicstabilityandparticipatingincellcycleregulation.Inthisstudy,Fank1geneknockdownmiceweresuccessfullyconstructedusingCRISPR/Cas9technology,andtranscriptomesequencingwasusedtocompareandanalyzeknockdownmiceandwild-typemice,andabatchofdifferentiallyexpressedgeneswerescreened.Furtherverificationfoundthatthesegenesarerelatedtogeneticandphysiologicalprocessessuchasbiologicalprocesses,molecularfunctions,andcellcomponents.ThisstudyprovidesanimportantreferenceforfurtherexploringtheroleoftheFank1geneintheorganismanditsinvolvementinlifeactivities.
Keywords:Fank1;geneknockdown;mice;differentialgeneexpression;lifeactivity
引言：
Fank1基因编码一种核酸酶，是Fanconi贫血（Fanconianemia）相关的核酸引物，参与调控DNA损伤修复、基因转录和蛋白翻译等生物过程，起着重要的生理学和遗传学作用。近年来，许多研究表明，Fank1与DNA损伤响应、信号传递、基因调控等生命活动密切相关，对机体的正常生长发育和疾病发生与发展有重要影响。
为了进一步探究Fank1基因在机体内的作用规律及其与生命活动的关联，本研究利用CRISPR/Cas9技术构建Fank1基因敲减小鼠，并用转录组测序技术对敲减小鼠和野生型小鼠进行比较分析，筛选出与Fank1基因敲减有关的差异表达基因，探究其在生物过程、分子功能和细胞组分等方面的作用及其与Fank1基因的相关性。
实验材料与方法：
材料：
敲减小鼠一只，野生型小鼠一只。
试剂：RNeasyMiniKit（Qiagen）、QubitRNAHSAssayKit（Invitrogen）、NEBNextUltraRNALibraryPrepKitforIllumina（NEB）。
实验方法：
1.Fank1基因敲减小鼠构建和鉴定：设计并合成一对RNA引物并引入小鼠胚胎中，筛选出携带Fank1基因杂合突变的小鼠，通过PCR，WesternBlot和测序技术对敲减小鼠和野生型小鼠进行鉴定，确认敲减小鼠的成功构建；
2.转录组测序：将小鼠肝脏组织进行组织学处理和总RNA提取，采用Qubit分析测定RNA浓度和质量，并利用NEBNextUltraRNALibraryPrepKitforIllumina进行建库。构建好的文库经过质控后进行高通量测序，并对测序结果进行处理和分析生成比对结果，利用DESeq2软件进行差异表达基因的分析；
3.差异表达基因筛选和验证：通过比较分析敲减小鼠和野生型小鼠中的基因表达水平差异，筛选出与Fank1基因敲减相关并显著差异表达的基因。对筛选出的基因进行实时荧光定量PCR验证。
结果：
1.Fank1基因敲减成功构建并鉴定：PCR、WesternBlot和测序结果均证实了Fank1基因敲减小鼠的成功构建。
2.转录组测序分析：对小鼠组织进行测序后，获得至少30G有效测序数据，质控图表明测序结果质量较好，比对率达到了90%以上。利用R包DESeq2进行差异表达基因分析，筛选出136个差异表达基因，其中98个基因表达上