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牡丹DGAT基因和PEPC基因的克隆及表达分析的中期报告
牡丹(Drabanemorosa)DGAT基因和PEPC基因的克隆及表达分析的中期报告
一、研究背景
近年来，DGAT(glycerol-3-phosohateO-acyltransferase)基因在脂质代谢研究中备受关注。DGAT可以将甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate)和脂肪酸合成三酰甘油(triacylglycerol)。
PEPC(phosphoenolpyruvatecarboxylase)则是植物陆上光合作用的重要酶，并参与到固定CO2的过程中。同时，PEPC还通过供给细胞的碳源来支持果实的营养来源。
牡丹(Drabanemorosa)是一种野生花卉，被普遍应用于抗旱耐寒等领域。但是，关于牡丹DGAT和PEPC基因的研究非常有限，因此对于这两个基因的功能和调控机制需要深入研究。
二、研究方法
1.总RNA提取
我们在生长期较好的牡丹植株中取下部叶片，采用TRIzol方法提取总RNA。通过Agarose凝胶电泳和NanoDrop光谱仪检测RNA纯度和完整性。
2.设计特异引物
基于前人研究，我们设计并合成特异引物，克隆牡丹DGAT和PEPC基因候选载体。
DGAT引物序列：
5'-ATGCTAAGCACCTCACATGCG-3'(forward)
5'-CTAAGGCAAGACTTGGGCATG-3'(reverse)
PEPC引物序列：
5'-ATGCTGGATGAAGTTTGAC-3'(forward)
5'-GAGCTGGAGTTCTTCCTGGT-3'(reverse)
3.RNA逆转录和基因克隆
采用PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit对提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA模板。利用特异引物对DGAT和PEPC基因进行PCR扩增，将扩增酶切后ligate到载体pEZ-M02中。将TOPO-TA菌落筛选后取出克隆文库，进行测序分析。
4.基因表达分析
我们选择将筛选出的基因共同质量转染至Viciafaba鱼籽Ⅰ期的叶子细胞中，并通过蛋白质印迹等手段验证基因表达是否发生变化。
三、研究进展
在提取的RNA中，我们观察到DGAT和PEPC的特异性条带，表明他们及时地被产生和表达。克隆文库含有约380个DGAT克隆和450个PEPC克隆，筛选结果符合预期。
在转染后，我们在转染组的叶子细胞中观察到了DGAT和PEPC的高表达情况，并验证了基因在转染组的高表达情况。正常情况下，组织表达水平较低的基因，在叶子细胞转染过程后可以得到显著提高的表达水平。
目前，我们正在对基因表达进行更深层的分析和研究，以更好地了解牡丹植物DGAT和PEPC的调控机制和功能。
四、结论
我们克隆了DGAT和PEPC的全长cDNA，对其进一步表达和功能分析还处在初步阶段。这项研究将为揭示DGAT和PEPC基因的作用方式和驱动机制提供重要信息，为从基因水平上了解牡丹的脂质代谢和光合途径奠定基础。