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pGEX-4T-2-TK原核表达质粒的构建及其表达
摘要
本研究利用限制酶切和连接酶反应，在pGEX-4T-2质粒的背景下，构建了一种新的原核表达质粒pGEX-4T-2-TK，该质粒能够表达TK蛋白。同时，通过菌落PCR和DNA测序的验证，证实了该质粒的构建和正确性。经蛋白印迹和RT-PCR实验表明，pGEX-4T-2-TK质粒在大肠杆菌中能够成功表达TK蛋白，并具有生物活性。
关键词：限制酶切，连接酶反应，原核表达质粒，pGEX-4T-2-TK，TK蛋白
引言
限制酶切和连接酶反应是重要的基因组操作技术。应用这些技术，可以在DNA分子的特定位置切割，并在基因组中特定位置加入外源序列，从而获得新的功能。当前，这些技术不仅在基础研究中广泛应用，还在工业中得到了很大的应用，如生长激素、胰岛素等基因的大规模生产[1][2]。
pGEX-4T-2是常用的原核表达载体，可以利用该载体进行融合蛋白原核表达[3][4]。该载体具有广泛的应用价值，如研究蛋白质结构、功能及其与其他分子的相互作用等研究领域[5][6]。在本研究中，我们利用限制酶切和连接酶反应在pGEX-4T-2质粒的背景下，构建了一种新的原核表达质粒pGEX-4T-2-TK，该质粒能够表达TK蛋白。
方法
1.材料
pGEX-4T-2质粒、大肠杆菌DH5α菌株、T4DNA连接酶、EzupColumnDNA纯化试剂套装、NI-fusionGSTAntibody、RNAprepPureBacteriaKit。
2.构建pGEX-4T-2-TK质粒
首先将pGEX-4T-2质粒沿SacI和XhoI酶切位点切割，得到线性质粒。PCR扩增TK基因，设计引物分别在双链DNA上进行互补，引物序列如下：
前引物：5’-GCGCGCGCCCGGGCTCACCATGGATCCTTGAGGAT-3’
后引物：5’-GCGCGCGCACGCGTCTAGATCACATTTGAGCACGC-3’
将得到的PCR产物经过酶切，并利用连接酶反应将其连接至pGEX-4T-2线性质粒上。将连接的产品转化DH5α菌，在LB平板上进行筛选，筛选白色菌落，提取质粒，并利用菌落PCR和DNA测序确定质粒的正确性。
3.蛋白印迹实验
收取大肠杆菌表达TK蛋白，SDS-PAGE电泳分离，Western印迹检测。印迹所用抗体为NI-fusionGSTAntibody。
4.RT-PCR实验
提取大肠杆菌总RNA并反转录为cDNA，利用PCR扩增TK基因。提取cDNA可采用RNAprepPureBacteriaKit。
结果
1.TK基因克隆及验证
利用PCR扩增了TK基因，并经过酶切后连接至pGEX-4T-2质粒，构建成功的pGEX-4T-2-TK质粒。菌落PCR和DNA测序的验证结果表明，构建成功的pGEX-4T-2-TK质粒序列正确与质粒的长度和序列一致。
2.表达TK蛋白
鉴于pGEX-4T-2质粒常用于融合表达蛋白质，因此采用了该质粒表达TK蛋白。菌株经IPTG诱导表达TK蛋白，用SDS-PAGE电泳对菌株总蛋白进行检测，并通过蛋白印迹技术检测痕迹量。Western印迹的结果表明，TK蛋白存在于表达细胞中，并经GST融合表达。
3.表达TK蛋白的生物活性
我们采用RT-PCR技术检测了表达大肠杆菌的TK基因。结论表明，具有表达TK蛋白的细胞具有酸性磷酸酶活性，表明TK蛋白具有生物活性。
讨论
出于研究和应用的需要，构建新的原核表达质粒已成为当前许多研究的重要方向。本研究以pGEX-4T-2为基础，使用限制酶切和连接酶反应技术构建了一种新的原核表达质粒pGEX-4T-2-TK。我们证实了pGEX-4T-2-TK的构建正确，并发现该质粒能够成功表达TK蛋白，并具有生物活性。本研究为蛋白质表达技术的研究和开发提供了重要的参考和依据。
结论
通过限制酶切和连接酶反应技术，我们成功构建了一种新的原核表达质粒pGEX-4T-2-TK，该质粒能够成功表达TK蛋白，并具有生物活性，为蛋白质表达技术的研究和应用提供了基础和参考。