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鲫鱼Kaiso基因cDNA的克隆及表达分析
摘要
鲫鱼是一种广泛分布于我国水域的淡水鱼类，其肉质优良，具有较高的经济价值和营养价值。本研究通过PCR扩增和克隆技术，成功克隆得到鲫鱼Kaiso基因的cDNA序列，并对其进行表达分析。结果表明，鲫鱼Kaiso基因在不同组织中表达具有差异性，其表达量最高的组织为肝脏。实时荧光定量PCR结果进一步证实了该基因在不同生长阶段的表达情况。
关键词：鲫鱼；Kaiso基因；cDNA克隆；表达分析
Abstract
CruciancarpisafreshwaterfishwidelydistributedinChina.Itsfleshisofhigheconomicandnutritionalvalue.Inthisstudy,thecDNAsequenceofKaisogeneincruciancarpwassuccessfullyclonedbyPCRamplificationandcloningtechnology,anditsexpressionanalysiswasperformed.TheresultsshowedthattheexpressionofKaisogeneindifferenttissuesofcruciancarpwasdifferent,andthehighestexpressionlevelwasinlivertissue.Real-timequantitativePCRresultsfurtherconfirmedtheexpressionpatternofthisgeneatdifferentgrowthstages.
Keywords:Cruciancarp;Kaisogene;cDNAcloning;expressionanalysis
1.引言
Kaiso基因是一种高度保守的转录因子，其在哺乳动物中表达广泛，在胚胎发育、细胞分化、组织修复和肿瘤形成中发挥着重要的生物学功能。近年来，有研究表明，在一些鱼类中也存在Kaiso基因，并且与内源性吞噬作用、抗氧化应激等生理过程密切相关。鲫鱼是我国重要的淡水鱼类，其肉质优良，具有高的市场需求和经济价值。为了更好地理解鲫鱼Kaiso基因在机体发育和过程中的生物学功能，本研究利用PCR扩增和克隆技术，成功克隆了鲫鱼Kaiso基因的cDNA序列，并分析了其在不同组织和生长阶段的表达情况。
2.材料与方法
2.1检材采集
本实验采用体长约15cm的成年鲫鱼为研究对象，分别从肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肌肉、鳃组织中取材。
2.2RNA提取、cDNA合成和PCR扩增
TotalRNAfromeachtissuewasisolatedusingTRIzolreagent(ThermoFisherScientific,USA)followingthemanufacturer'sinstructions.ThefirststrandcDNAwassynthesizedfrom1μgtotalRNAusingthePrimeScript™RTreagentkit(Takara,Japan).ThePCRamplificationwasperformedusingcDNAastemplateandprimersdesignedbasedontheKaisogenesequenceinGenBank(AccessionNo.XM_031074982.1).ThePCRconditionswereasfollows:95℃for5min,then35cyclesof95℃for30s,55℃for30s,and72℃for1min,andafinalextensionat72℃for10min.ThePCRproductswereanalyzedbyagarosegelelectrophoresis.
2.3cDNA克隆和序列分析
ThePCRproductsofKaisogenewerepurifiedandclonedintothepMD19-Tvector(Takara,Japan)forsequencing.ThepositiveclonesweresequencedbySangonBiotech(Shanghai)Co.,Ltd.usingtheSangersequencingmethod.ThesequencewasthenanalyzedusingBLASTandDNASTARsoftware.
2.4实时荧光定量PCR
Real-timequantitativePCRwasperformedonanABI7500system(AppliedBiosystems,USA)usingtheSYBRGreenIMastermix(