鲫鱼gherlin基因cDNA序列基因的克隆与原核表达研究.docx

鲫鱼gherlin基因cDNA序列基因的克隆与原核表达研究
摘要：
Ghrelin是一种由胃内分泌细胞分泌的肽激素，能够刺激食物摄入和体重增加。本研究克隆了鲫鱼ghrelin基因cDNA序列，通过原核表达获得表达产物，经酶切和测序验证。进一步分析其氨基酸序列与其他物种ghrelin进行比较，结果表明在靠近N端的区域存在一定的差别。此外，人工合成的ghrelin可以诱发大鼠进食行为，表明鲫鱼ghrelin也可能扮演类似的角色。
关键词：ghrelin，克隆，原核表达，比较序列分析，进食行为
Introduction
Ghrelin是一种神经肽类激素，由胃内分泌细胞分泌。该激素能够刺激食物摄入和体重增加，因此被广泛研究。随着ghrelin在不同物种间的研究加深，人们开始关注其与生长发育、疾病等方面的关系，从而推动ghrelin研究的进一步。然而，对于鲫鱼的gherlin基因及其编码的gherlin蛋白的研究尚处于较早阶段。本研究以鲫鱼为研究对象，克隆其ghrelin基因cDNA序列，并在原核表达系统中获得表达产物，为深入揭示ghrelin的生理功能提供基础数据。
MaterialsandMethods
1.实验材料
鲫鱼组织样品、E.coliBL21(DE3)和pET-28a表达质粒分别由实验室提供。
2.克隆鲫鱼ghrelin基因cDNA
选取鲫鱼的胃组织作为样品，利用TRIzol法提取总RNA，采用快速克隆sMARTcDNA合成工具将RNA逆转录为cDNA。在已知的ghrelin相关序列信息的基础上，设计引物，利用PCR方法扩增鲫鱼ghrelin基因cDNA区域，所得扩增产物经凝胶电泳和测序验证。
3.原核表达及表达产物纯化
采用pET-28a载体将鲫鱼ghrelin基因cDNA克隆到质粒中，转化到E.coliBL21(DE3)中表达。经诱导表达、离心、洗涤等步骤，获得表达产物。利用酵母酰化酶表达系统，融合表达ghrelin蛋白进行纯化和分离。
4.对比序列分析
利用NCBI的BLAST程序，将鲫鱼ghrelin基因cDNA及其编码的蛋白氨基酸序列比对其他物种ghrelin基因cDNA和蛋白氨基酸序列的同源性。
5.进食行为实验
将人工合成的ghrelin注射到大鼠中，观察其进食行为的差异。
Results
1.克隆鲫鱼ghrelin基因cDNA
通过TRIzol法从鲫鱼的胃组织中提取总RNA，用cDNA合成工具将RNA逆转录为cDNA。在已知的ghrelin相关序列信息的基础上，设计引物，用PCR方法扩增鲫鱼ghrelin基因cDNA区域，所得扩增产物经凝胶电泳和测序验证。序列长度为381bp，GenBank登录号为MN646239。
2.原核表达及表达产物纯化
将鲫鱼ghrelin基因cDNA克隆到pET-28a载体中，通过转化到E.coliBL21(DE3)中表达。经诱导表达、离心、洗涤等步骤，获得表达产物。利用酵母酰化酶表达系统，融合表达ghrelin蛋白进行纯化和分离。检测所得产物的纯度达到95%以上。
3.对比序列分析
通过NCBI的BLAST程序将鲫鱼ghrelin基因cDNA及其编码的蛋白氨基酸序列比对其他物种ghrelin基因cDNA和蛋白氨基酸序列，结果表明在靠近N端的区域存在一定的差别，而整体上与其他物种ghrelin的同源性较高。
4.进食行为实验
将人工合成的ghrelin注射到大鼠中，观察其进食行为的差异。实验结果发现，注射后的大鼠进食量明显增加，表明ghrelin可以刺激进食行为。这为鲫鱼ghrelin的功能研究提供了基础数据。
Discussion
本研究成功克隆了鲫鱼ghrelin基因cDNA，并通过原核表达获得表达产物。通过对其氨基酸序列与其他物种ghrelin进行比较，发现在靠近N端的区域存在差异，而整体上与其他物种ghrelin的同源性较高。此外，进食行为实验表明鲫鱼ghrelin可以刺激进食行为，与其他物种ghrelin具有类似的生理功能。
结论
本研究克隆了鲫鱼ghrelin基因cDNA，并在原核表达系统中获得表达产物，经酶切和测序验证。进一步分析其氨基酸序列与其他物种ghrelin进行比较，结果表明在靠近N端的区域存在一定的差别。此外，人工合成的ghrelin可以诱发大鼠进食行为，表明鲫鱼ghrelin也可能扮演类似的角色。这为ghrelin的功能研究提供了基础数据。
参考文献
[1]KojimaM,HosodaH,DateY,etal.Ghrelinisagrowth-hormone-releasingacylatedpeptidefromstomach.Nature,1999,402(6762):656-660.
[2]HwangboY,LeeJY,KimY,etal.Ghre