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黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化
引言
干细胞治疗作为一种新型医学技术，已成为当前研究热点。而人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUCMSCs）具有体内/外多向分化能力，来源广泛且培养容易等优点，被广泛应用于组织工程、干细胞治疗和细胞治疗等不同领域（Dominicietal.，2006）。同时，许多研究表明hUCMSCs具有较好的神经再生修复作用，是治疗神经退行性疾病的理想细胞来源（Meirellesetal.，2006）。因此，研究怎样有效的将hUCMSCs诱导向神经细胞分化具有十分重要的意义。
黄连素（Berberine）是从黄连（CoptischinensisFranch）等植物中提取的一种天然生物碱，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抑制细胞增殖等多种药理作用（Lietal.，2012；Yuanetal.，2009）。研究表明，黄连素能够促进神经干细胞（Neuralstemcell，NSCs）向神经元分化，并可以在神经元中诱导神经样细胞表型的表达（Zhangetal.，2014）。包括我们实验室在内的一些研究，已经探究了黄连素对神经干细胞分化的影响；在这些领域中，黄连素的生物学效应一直是研究的热点。但还没有任何研究报道过该化合物对hUCMSCs神经分化的影响及可能的分子机制。
本研究在前期我们实验室研究基础上，探究了黄连素对hUCMSCs分化为神经样细胞的调控作用和可能的机制，为开发干细胞治疗神经性疾病等提供理论依据和实验基础。
方法
实验材料
hUCMSCs分离、培养和鉴定。本实验采用颇为成熟的协定程序，由母亲无子女史及无手术剖宫产经历或母婴其他医学隐患且联系本实验所在医院体检中心者签署知情同意书后，经医院产房顺产婴儿肾上腺隔离方法活检取得在出生时脐带(1-5g)，迅速置于含生理盐水和抗生素的冰盐水溶液中，送至实验室进行分离，详见扩增方法部分。
黄连素(purity>98%,Sigma，USA)。
实验设计
试验按照实验室规范进行，主要包括以下步骤：
培养解决协定的hUCMSCs10-12天达到接近100%的单层细胞
重悬细胞，给予神经分化培养基(详见下部分)在仔细处理细胞，并对其分别加入0（对照组）、20、40、60、80μmol/L黄连素。细胞在37℃、5%CO2，85%相对湿度下培养10天。
通过H&E组织病理学染色直接观察细胞形态变化。
流式细胞术检测hUCMSCs的神经细胞特异性标志物—微管相关蛋白2（MAP2）和神经元特异性烯醇酸（Neurofilament，NF）的表达。
通过RT-PCR探究黄连素对hUCMSCs神经分化相关基因mRNA的表达(详见表1)。
Westernblot检测黄连素对神经分化相关蛋白的表达，包括βIII-tubulin、NF、MAP2、TAU这些蛋白的表达。
数据分析
实验结果数据用SPSS17.0软件进行Statistical、analysis，以平均值±SD（standarddeviation）方式描述。资料组间差异比较采用方差分析（One-wayANOVA）或t检验。差异显著度用P<0.05作为阈值。
结果
hUCMSCs经黄连素诱导具有神经细胞样的形态和功能
在神经分化培养基中，hUCMSCs神经分化呈现两种不同形态。最显著的特点是细胞形态变得更加分散，而且由于细胞体积变小，同时细胞间联系减少。我们用invivoH&E染色发现μmol/L黄连素的组织学照片（图1）：对于分化后的hUCMSCs，与对照组相比，明显的神经细胞样形态的变化，其他基础的蛋白分子也发生了控制性改变。
不仅如此，通过流式细胞术进一步检测，我们得到了来自hUCMSCs的神经分化标志物MAP2、NF的表达呈现上升趋势。同时，黄连素在神经分化作用了之后也调控了MAP2、NF的表达（图2）。
在至少3次独立实验后，我们通过RT-PCR表明，黄连素对hUCMSCs神经分化的影响可以通过几个关键神经分化相关基因的mRNA水平表达来反映。在分化后的hUCMSCs中，microtubulin-associatedprotein2(MAP2)、Beta-tubulinIII、neuralfilament(NF)和microtubule-associatedproteinTau(TAU)mRNA表达水平都有一定程度的上升。而在加入0-80μmol/L黄连素的任意浓度下，这些基因的表达都出现了一个剂量相关的增加趋势（图3）。
此外，通过Westernblot分析，我们还进一步证明了黄连素对hUCMSCs神经分化的调控作用。黄连素可以明显地促进βIII-tubulin、NF、MAP2、TAU这几个神经蛋白的表达（图4）。
讨论
hUCMSCs具有