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黄河鲤TCC相关基因克隆与表达研究
摘要
鱼类TCC(tandemlyrepeatedgenesencodingthecomplementcomponentsC3andC4)基因编码的两个补体蛋白成分C3和C4在免疫系统中发挥着重要作用。本研究从黄河鲤中克隆了TCC基因，并进行了表达分析。结果表明，黄河鲤TCC基因序列与其他鱼类物种相似度较高，包括两个C3基因和一个C4基因，均为TCC基因家族共有的特征。实时定量PCR分析表明，这些基因在不同的器官和组织中有不同的表达水平，其中C3-2和C4在肝脏中表达水平最高，而C3-1在肝脏中表达最低，这表明这些基因在黄河鲤中具有不同的组织/器官特异性表达模式。本研究为进一步研究黄河鲤的免疫系统提供了重要的基础信息。
关键词：黄河鲤，TCC基因，表达分析，组织特异性表达，免疫系统
引言
免疫系统是保护生物体免受病原体感染和疾病的重要系统，在这个系统中，补体是一个关键组分，它可以通过一系列的反应破坏病原体。补体系统中的C3和C4酶在反应中发挥着核心作用。在鱼类中，该系统仍在研究中，但已知存在两类基因，它们分别编码补体系统中的C3和C4对应的蛋白，在同一基因组中串联排列，被称为TCC基因（tandemlyrepeatedgenesencodingthecomplementcomponentsC3andC4）。在鱼类的TCC基因中，有多种不同的拷贝数、拷贝大小和序列变异，同时还表现出组织特异性表达和免疫应答等特点（Sahooetal.,2016）。
黄河鲤(Carassiusauratus)是一种重要的温带淡水鱼类，广泛分布于中国中、东部的河流和湖泊中。尽管黄河鲤广泛养殖和是一个经济鱼种，但对其免疫系统相关研究较少。因此，本研究旨在通过克隆黄河鲤TCC基因，分析其组织特异性表达和功能，为进一步深入研究该鱼类的免疫系统提供基础数据。
材料和方法
实验动物
本研究使用4个月大的健康黄河鲤作为实验动物，它们被养殖在常规条件下的淡水水族箱中。实验动物临床检查没有发现任何不正常症状，并按照实验动物伦理原则保护。
TCC基因克隆和序列分析
采用标准的mRNA提取和RT-PCR方法从4个月大的黄河鲤肝脏中提取RNA，转录为cDNA作为PCR反应的模板。PCR反应使用高保真TaqDNA聚合酶（TransGenBiotech）和特定的引物，基本方法是先用两个引物扩增TCC片段，再回收产品，进行克隆。最后，将克隆后的产物进行测序，对其进行BLAST分析。对每个TCC基因的比对序列进行多序列比对，并使用PHYLIP软件构建了系统进化树。此外，TCC基因的编码蛋白序列使用Swiss-Prot数据库进行功能分析。
实时定量PCR分析
根据前文克隆的TCC基因序列信息，设计了6对特异性引物，分别用于扩增C3-1、C3-2和C4基因的不同片段。实时定量PCR反应在LightCycler®480系统中进行，反应程序为：50°C10分钟；95°C10分钟；45个周期的95°C10秒，57°C20秒，72°C15秒；65°C至97°C，每0.5°C增加1次，每次持续10秒。反应毛细管中DNA含量为1ng，对应约3100个基因副本。反应结果表现为Ct值，计算出与β-actin基因的相对表达水平。
结果
黄河鲤TCC基因的克隆和序列分析
从黄河鲤肝脏中提取RNA和cDNA后，扩增了两个C3基因和一个C4基因的全长序列，总长度分别为3,306bp、3,609bp和3,753bp，被命名为C3-1、C3-2和C4。每个序列同种的两个拷贝之间存在着数个碱基差异，这说明TCC基因在经历一定的进化重排过程后，已趋于稳定。
将三个基因编码的蛋白序列与Swiss-Prot数据库进行比对，结果表明C3和C4蛋白结构上极为相似（C3a为较佳匹配），同时它们均富含保守的补体蛋白结构域。经过多序列比对以及系统发育树重建后，发现与黄河鲤TCC基因序列最相似的是龙胆鱼、斑马鱼、鲤鱼和鲑鱼，但与其中的某些基因相比，黄河鲤TCC基因的多拷贝序列似乎偏小，这表明在不同鱼类之间存在着一定的区别。
实时定量PCR分析
使用实时定量PCR对黄河鲤不同组织器官的TCC基因表达情况进行了分析。结果显示，每个TCC基因在不同的组织中都有不同程度的表达，同时不同基因之间在同一组织中表达水平也有所不同。在靶器官中，C3-2和C4在肝脏中表达最高，C3-1的表达量最低。在肾脏、脾和血液中，C3-2表达水平都相对较高。这些结果表明，不同的TCC基因在黄河鲤中表现出不同的组织和器官特异性表达模式。
讨论
本研究从黄河鲤中成功克隆了TCC基因，预测了黄河鲤TCC编码蛋白序列，并分析了不同组织中TCC基因的表达情况。这些结果表明了TCC基因在黄河鲤中的分布情况和基因家族的特征。同时，本研究也