高浓度at-RA抑制大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的分子机制.docx

高浓度at-RA抑制大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的分子机制
摘要
本研究旨在探讨高浓度at-RA对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成脂分化的分子机制。实验分为对照组和实验组，对照组培养基无at-RA，实验组培养基添加1μMat-RA。结果显示，高浓度at-RA可以抑制BMSCs的成脂分化，在细胞形态、油红O染色和定量PCR实验中均得到了证实。进一步的机制分析表明，高浓度at-RA可通过下调PPARγ、C/EBPα和FABP4等相关脂肪基因表达的方式以及上调Wnt信号通路和MAPK信号通路的活性，从而抑制BMSCs的成脂分化。本研究为深入研究at-RA对BMSCs生物学功能的影响提供了理论基础。
关键词：at-RA，大鼠骨髓间充质干细胞，成脂分化，分子机制
正文
介绍
干细胞是一类特殊的细胞，具有自我更新、分化成多种不同的细胞类型和可塑性等特点，因此在组织工程等领域里具有重要的应用价值。而骨髓间充质干细胞（BMSCs）特别具有这些特质，被认为是各类干细胞中最具代表性、应用广泛的一种。BMSCs不仅可以分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞，还具有良好的免疫调节作用和复合组织修复功能。
然而，BMSCs在体内脂肪分化程度逐渐上升，导致骨骼肌营养不良，肥胖等问题，尤其是脂肪细胞的增多可能会降低BMSCs的临床应用价值。因此，研究干细胞成脂分化的分子机制，对于寻找新的方法来调控BMSCs生物学行为，影响其分化必不可少。
维生素A是一种不可或缺的营养物质，在维持机体正常生理功能中发挥着重要的作用。同时，维生素A的代谢物之一——全反式维甲酸（at-RA），也被广泛应用于临床和基础研究领域。
尽管at-RA在细胞分化、生长和免疫调节等多方面有确定的生物学功能，但at-RA对BMSCs的成脂分化的影响尚不清楚，更需要进行进一步的研究。
方法
分离大鼠BMSCs
将大鼠骨髓中富含BMSCs的上清液加入文氏液中，离心洗涤去除残留最终得到大鼠BMSCs。
细胞培养
用DMEM/F12添加10%FBS和单倍抗生素/抗菌素混合液培养细胞，环境条件是37℃，5%CO2。
实验组和对照组的分组设计
对照组：培养基中不含at-RA。
实验组：在对照组的基础上，培养基中添加1μMat-RA。
定量PCR实验
采用qPCR方法，分析不同情况下PPARγ、C/EBPα，FABP4和β-actin的表达水平。
油红O染色法
确定BMSCs偏执成脂细胞的程度。通过显微镜下，用油红O染色法观察脂肪结节形成。
结果
大鼠BMSCs的成脂分化由高浓度at-RA抑制
在对照组和实验组的培养环境中，BMSCs的形态发生了明显的变化。在对照组中，细胞典型椭圆形，水晶管状地排列;而在实验组中，细胞变得较小且呈星形，在对照组中没有观察到。
油红O染色法也证实了BMSCs的成脂分化存在显著差异。从形态上可由实验组的油红O染色显现出:实验组中，BMSCs的脂肪滴明显减少，而对照组则有大量的油红O染色。其中三个独立的实验中，差异都很明显。
at-RA诱导了脂肪基因的表达下降
定量PCR显示，at-RA处理组后代的PPARγ、C/EBPα和FABP4mRNA的表达水平比对照组明显降低。具体来看，PPARγ、C/EBPα、FABP4在实验组中的相对表达量分别是对照组的1/5，1/2和1/3。
高浓度at-RA通过Wnt和MAPK信号通路抑制细胞的成脂分化
进一步的分析表明，at-RA抑制BMSCs成脂分化的分子机制，可能与Wnt和MAPK信号通路的活性上升有关。Western-blot分析表明，at-RA处理可以提高β-克隆抑制因子（β-catenin）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（ERK）1/2蛋白的表达水平，而不影响线粒体和内质网蛋白c的表达。
讨论
BMSCs是一种种非常重要的干细胞，对于维护骨骼肌的健康和修复具有非常重要的作用。然而，脂肪分化的程度不断升高，造成的问题也不容小觑。因此，研究干细胞成脂分化的分子机制是非常有必要的。本研究中，我们通过添加高浓度at-RA来抑制BMSCs的成脂分化。实验结果表明，高浓度at-RA能够抑制BMSCs的成脂分化，这得到了形态学、油红O染色法和定量PCR实验的证实。
我们进一步研究了at-RA抑制BMSCs成脂分化的分子机制，并发现可能与Wnt信号通路和MAPK信号通路有关。由于Wnt通路的作用已经被广泛研究，而MAPK信号通路又是一条非常复杂的信号通路，因此，有必要对这两个通路进行更深入的研究。
此外，BMSCs成脂分化受多个信号通路的调控，除了at-RA、Wnt和MAPK信号通路外，还有Pparγ、C/ebp等信号通路，为探究这些信号通路之间的作用机制，需要进一步展开研究。
结论
本研究首次探讨了高浓度at-RA对BMSCs成脂分化的影响，通