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重组酿酒酵母中CIT2基因的敲除及对其木糖代谢的影响
摘要：
本研究旨在通过CRISPR-Cas9技术敲除重组酿酒酵母中的CIT2基因，探究其对酵母的木糖代谢的影响。实验设计了敲除CIT2基因的酿酒酵母菌株和野生型酿酒酵母菌株进行对比实验。通过发酵实验和分析木糖浓度、菌群量、乙醇和丙酮的生产等指标，发现敲除后的酵母对木糖的利用效率降低，产生的乙醇和丙酮显著减少，而野生型酿酒酵母则能够更好地利用木糖和产生更多的乙醇和丙酮。这些结果表明，CIT2基因对酿酒酵母的木糖代谢具有重要的影响。
关键词：CRISPR-Cas9，CIT2基因，酿酒酵母，木糖代谢
引言：
木糖是葡萄糖代谢途径中的一个副产物，存在于包括木质纤维素和果胶在内的一些植物生物中。在酿酒过程中，使用收获的果实和谷物进行发酵，而木糖也会出现在发酵物中。然而，酿酒酵母并不像某些嗜糖真菌和细菌一样能够高效地代谢木糖，这意味着如果不对酿酒酵母进行优化，它们会将一部分木糖浪费掉，从而减少酒的醇度和产量。
酿酒酵母向木糖代谢的途径涉及多个基因和途径。其中，CIT2基因是木糖代谢的关键基因之一。该基因编码CitrateSynthaseII（CSⅡ），它是木糖代谢中的一个重要酶，催化无机盐（如氯化物）介导的芳香族羧酸的反应，将其转变为丙酮酸和乙酸。CIT2基因被发现在多种酿酒酵母菌株中，这表明它在酵母的木糖代谢中必不可少。然而，目前对CIT2基因的研究还局限于实验基因组，未在实际酿酒过程中进行研究。
因此，本研究旨在通过CRISPR-Cas9技术敲除重组酿酒酵母中的CIT2基因，探究其对酵母的木糖代谢的影响。
材料和方法：
1.酿酒菌株
本研究使用酿酒酵母菌株作为试验对象。包括敲除CIT2基因的酿酒酵母菌株（CIT2-KO菌株）和野生型酿酒酵母菌株（WT菌株）。
2.CRISPR-Cas9介导的敲除CIT2基因
使用CRISPR-Cas9技术敲除CIT2基因。首先通过实验的处理和分离筛选得到CIT2-KO菌株。Cq-CAS9和Cq-RNA是用于CIT2-KO菌株制备介导突变的质粒。将Cq-RNA质粒与Cq-CAS9质粒一起转化CIT2-KO菌株，筛选得到突变位点。
3.酵母代谢实验
斯氏培养基是用于这些代谢实验的基础培养基。实验期间木糖是与葡萄糖混合的，在开始时木糖和葡萄糖的比例为3：7。将CIT2-KO菌株和WT菌株分别接种到斯氏培养基中，让它们在温度为25°C，速度为200rpm的条件下发酵48小时。在发酵过程中采样，并测量乙醇和丙酮的产量，并测量木糖、葡萄糖和残余糖的浓度，并定量测定每个样本的菌群量。
结果：
通过CRISPR-Cas9技术成功地敲除了实验室酿酒酵母中的CIT2基因，得到了敲除后的酿酒酵母菌株（CIT2-KO菌株）。然后，进行了木糖代谢实验，以比较CIT2-KO菌株和野生型酿酒酵母菌株（WT菌株）对木糖的代谢率和乙醇丙酮产量的差异。
结果显示，与WT菌株相比，CIT2-KO菌株对木糖的利用效率显著降低，产生的乙醇和丙酮数量明显减少。此外，48小时结束后，CIT2-KO菌株仍然有残余的木糖和葡萄糖，而WT菌株则将它们全部使用完。最后，CIT2-KO菌株的菌群量与WT菌株的菌群量相差不大。
结论：
本研究通过CRISPR-Cas9技术敲除CIT2基因，探究了该基因对酿酒酵母木糖代谢的影响。结果表明，敲除CIT2基因后的酿酒酵母对木糖的利用效率降低，产生的乙醇和丙酮显著减少，而WT菌株则能够更好地利用木糖和产生更多的乙醇和丙酮。这表明，CIT2基因对酿酒酵母的木糖代谢具有重要的影响。
尽管敲除CIT2基因不会影响酿酒过程中的总产量，但它们确实会减少发酵物中的乙醇和丙酮含量，这可能会影响酿酒的口味和营养价值。因此，对木糖代谢途径的优化和研究对于酿酒酵母的研究和酿酒工程的提高至关重要。
参考文献:
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3.Lia