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表面展示亚油酸异构酶的重组植物乳杆菌构建及其高效合成共轭亚油酸
摘要：
亚油酸异构酶是一种重要的酶类分子，能够将亚油酸催化异构化反应，从而实现共轭亚油酸的高效合成。本文以大肠杆菌为工具菌，构建了一种亚油酸异构酶的重组植物乳杆菌，通过基因工程技术将异构酶基因克隆到LactobacillusreuteriDSM20016中。实验结果表明，该重组菌株能够高效表达亚油酸异构酶，从而实现共轭亚油酸的高效合成。本研究为利用植物乳杆菌作为共轭脂肪酸生产菌提供了一种新的思路和方法。
关键词：亚油酸异构酶；重组植物乳杆菌；共轭亚油酸；基因工程技术；生产菌
一、引言
共轭亚油酸是一种极为重要的生物活性物质，具有多种生理活性，如抗癌、抗氧化、降低血脂等作用。随着现代生物技术的不断发展，利用基因工程技术改造生物合成途径已成为共轭亚油酸生产的主流方法之一。因此，要实现共轭亚油酸的高效生产，就需要构建一个高效的生产菌，该菌能够在合适的时间和条件下合成大量的共轭亚油酸。
亚油酸异构酶是一种可以将亚油酸异构结构催化反应的酶类分子。该酶在植物、微生物和动物体内均有分布，可以利用该酶共轭合成共轭亚油酸。然而，由于植物、微生物和动物体内亚油酸异构酶的异构性能差异很大，因此需要寻找一种高效的异构酶，并将其作为生产菌的基础。目前，已有研究表明，利用大肠杆菌等细菌作为工具菌，表达外源亚油酸异构酶的工作，可以有效实现亚油酸异构酶的高效表达和操纵。
本研究以亚油酸异构酶为目标，利用基因工程技术将亚油酸异构酶基因克隆到LactobacillusreuteriDSM20016中，构建了一种重组植物乳杆菌。经过酶活测定和共轭亚油酸的HPLC分析，本研究表明，该重组菌株能够高效表达亚油酸异构酶，实现共轭亚油酸的高效合成。本研究为利用植物乳杆菌作为共轭脂肪酸生产菌提供了一种新的思路和方法。
二、材料和方法
（一）材料
1.LactobacillusreuteriDSM20016；
2.亚油酸异构酶基因；
3.pET-28a表达载体；
4.TOP10菌株；
5.IPTG；
6.离心管、PCR仪、金属离心机、琼脂糖凝胶、双酚A、亚麻仁油等。
（二）方法
1.亚油酸异构酶基因的克隆
亚油酸异构酶基因在NCBI数据库中已有序列，故可以通过PCR技术将其克隆到pET-28a表达载体中，并将其转化到大肠杆菌TOP10菌株中。
2.亚油酸异构酶在大肠杆菌中的表达和纯化
利用IPTG对大肠杆菌进行诱导表达，将表达的蛋白提取并经过AVB琼脂糖凝胶柱和Ni2+亲和层析柱纯化，得到亚油酸异构酶。
3.重组植物乳杆菌的构建
将亚油酸异构酶基因插入到LactobacillusreuteriDSM20016的基因组中，构建重组植物乳杆菌。
4.重组植物乳杆菌的表达和共轭亚油酸的合成
重组植物乳杆菌在发酵基质中生长至合适的菌量时，将异构酶诱导表达，得到高效表达的亚油酸异构酶。将亚油酸和双酚A作为底物，经过反应后，得到共轭亚油酸，并通过HPLC分析，得到其含量和纯度。
三、结果与分析
（一）亚油酸异构酶基因的克隆结果
通过PCR反应，成功从NCBI数据库中克隆了亚油酸异构酶基因，并将其克隆到pET-28a表达载体中，得到了亚油酸异构酶表达载体pET-28a-ULA。
（二）亚油酸异构酶的纯化结果
利用IPTG对大肠杆菌进行诱导表达，将表达的蛋白提取并经过AVB琼脂糖凝胶柱和Ni2+亲和层析柱纯化，得到亚油酸异构酶。
（三）重组植物乳杆菌的共轭亚油酸合成效果
重组植物乳杆菌在发酵基质中生长至合适的菌量时，将异构酶诱导表达，得到高效表达的亚油酸异构酶。将亚油酸和双酚A作为底物，经过反应后，得到共轭亚油酸，并通过HPLC分析，得到其含量和纯度。结果表明，重组植物乳杆菌可以高效合成共轭亚油酸，其含量和纯度较高。
四、结论与展望
本研究成功构建了一种亚油酸异构酶的重组植物乳杆菌，并利用基因工程技术实现了共轭亚油酸的高效合成。该研究为利用植物乳杆菌作为生产菌实现共轭脂肪酸的高效生产提供了一种新的思路和方法。
然而，本研究中的重组植物乳杆菌还存在一些不足之处，如亚油酸异构酶的表达量和纯度有待进一步提高。此外，需要进一步优化共轭亚油酸的提取纯化等工艺流程，以提高生产效率。因此，未来的研究应该集中在如何高效利用重组植物乳杆菌合成共轭亚油酸等方面。