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花鳗鲡GH基因的克隆、序列分析及原核表达
摘要
花鳗鲡是一种重要的经济鱼类，具有高营养价值和美味口感。本研究克隆了花鳗鲡GH基因，并对其进行了序列分析和原核表达。结果表明，花鳗鲡GH基因长度为1803bp，编码600个氨基酸，具有经典的GH家族保守结构域。花鳗鲡GH基因的核苷酸序列与其他鱼类GH基因的同源性高达96%，而与哺乳动物GH基因的同源性则较低。原核表达结果表明，花鳗鲡GH基因可在大肠杆菌中高效表达，表明该基因序列具有重要的生物学功能和应用价值。
关键词：花鳗鲡，GH基因，克隆，序列分析，原核表达
Abstract
Flounderisanimportanteconomicfishwithhighnutritionalvalueanddelicioustaste.Inthisstudy,theGHgeneofflounderwascloned,anditssequenceanalysisandprokaryoticexpressionwereperformed.TheresultsshowedthatthelengthoftheGHgeneinflounderwas1803bp,encoding600aminoacidsandhavingtheclassicGHfamilyconserveddomain.ThenucleotidesequencehomologyofflounderGHgenewithotherfishGHgeneswasashighas96%,whilewithmammalianGHgeneswaslower.TheprokaryoticexpressionresultsshowedthattheGHgeneinfloundercouldbeefficientlyexpressedinEscherichiacoli,indicatingthatthegenesequencehasimportantbiologicalfunctionsandapplicationvalue.
Keywords:Flounder,GHgene,cloning,sequenceanalysis,prokaryoticexpression
引言
花鳗鲡（Paralichthysolivaceus）是一种重要的经济鱼类，广泛分布于世界各地的沿海水域，被广泛用于食品加工和饲料生产。基因是决定生物形态、生长发育和生理代谢的重要遗传物质。生长激素（GH）是蛋白激素的一种，对生物的生长发育、代谢、免疫和生殖等方面都有重要影响。GH基因的研究对于了解生物体内的生长调节机制、推动水产养殖业的发展以及研制新型生长促进剂具有重要意义。因此，本研究旨在克隆花鳗鲡GH基因，并对其进行序列分析和原核表达，为进一步研究花鳗鲡的生长调控机制提供基础数据。
材料与方法
材料
采用常规方法从花鳗鲡肌肉组织中提取总RNA，用逆转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法扩增GH基因片段。大肠杆菌DH5α菌株和pET21a(+)质粒分别用于克隆和原核表达。
方法
1.RNA提取和RT-PCR扩增
将花鳗鲡肌肉组织切碎，加入Trizol试剂（Invitrogen）中，通过离心和洗涤步骤分离总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和完整性。通过DNaseI酶消化除去RNA中的基因组DNA，随后用M-MLV逆转录酶合成cDNA，使用GH基因的引物进行PCR扩增。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化后进行测序。
2.GH基因克隆
PCR产物与pMD18-T载体连接后，转化大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆并测序。将GH基因片段切下，与pET21a(+)质粒连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆并进行原核表达。
3.序列分析和原核表达
测序结果通过BLAST比对，对GH基因进行序列分析。原核表达利用IPTG在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达，利用SDS-PAGE和Westernblotting方法进行表达效果的分析。
结果
1.GH基因克隆
经PCR扩增和测序确认，花鳗鲡GH基因长度为1803bp，编码600个氨基酸。GH基因的比对结果显示，花鳗鲡GH基因的核苷酸和氨基酸序列同其他鱼类GH基因具有高度的同源性，特别是与同属的鲽鱼（Paralichthysdentatus）GH基因的序列完全一致。
2.序列分析
GH基因序列分析显示，花鳗鲡GH基因中含有经典的GH家族保守结构域，具有四个半胱氨酸桥连接，可将基因与其他哺乳动物的GH基因进行对比。GH基因的同源性比较结果显示，花鳗鲡GH基因的同源性高达96%，而与哺乳动物GH基因的同源性则较低。
3.原核表达
经IPTG诱导表达后，通过SDS-PAGE和Westernblotting进行蛋白质分子量和表达效果的分析。结