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苏云金芽胞杆菌新型杀虫晶体蛋白基因的克隆及其功能研究
摘要：
本研究通过对苏云金芽胞杆菌的基因组测序数据进行筛选，克隆出了其新型杀虫晶体蛋白基因。经过进一步的分析，发现该基因在杀虫过程中发挥着重要的作用，其编码的晶体蛋白可直接作用于昆虫的消化道，导致其死亡。同时，对该基因的功能进行了深入的研究，为今后开发更为安全、高效的杀虫剂提供了理论基础。
关键词：苏云金芽胞杆菌，杀虫晶体蛋白，克隆，功能研究
1.引言
杀虫剂是一种在现代农业中被广泛使用的农药，其使用范围包括农业、林业、家庭等各个领域，可有效地控制害虫数量，保障作物的生长发育。早期的杀虫剂多为化学合成物，其毒性高、安全系数低，常常会对环境和人类健康造成危害。因此，当前农业领域正在逐步地向生物农药转型。生物农药不仅具有杀虫效果好、安全性高等优点，而且对环境没有任何污染。
苏云金芽胞杆菌是一种常见的土壤细菌，具有广泛的杀虫谱。其作为生物农药的研究对象已经引起了越来越多的关注。目前已经有许多研究表明，苏云金芽胞杆菌在消灭害虫上具有良好的效果，并且对人体以及环境均无任何危害。
杀虫晶体蛋白是苏云金芽胞杆菌的一种重要代谢产物，在杀害昆虫上具有重要的作用。本研究的目的在于利用克隆技术，从苏云金芽胞杆菌中分离出新型的杀虫晶体蛋白基因，并对其进行功能分析。
2.材料与方法
2.1材料
本研究所使用的苏云金芽胞杆菌菌株为国家农业科技成果转化项目“苏云金芽胞杆菌生产及应用”研究所提供的菌株。
2.2方法
2.2.1DNA提取和测序
使用Qiagen的DNA提取试剂盒进行苏云金芽胞杆菌基因组DNA的提取。将提取得到的DNA质量检测，质控标准为OD260/280在1.8~2.0之间。
对苏云金芽胞杆菌的基因组DNA进行全基因组测序，并利用SPAdes软件的多组装程序对基因组测序数据进行组装。
2.2.2基因筛选和克隆
通过基因组测序数据进行筛选和比对，找出苏云金芽胞杆菌中可能编码杀虫晶体蛋白的基因。利用PCR扩增所筛选出的基因编码区，并将其纯化后进行克隆。
2.2.3功能研究
将克隆得到的杀虫晶体蛋白基因编码区序列插入到表达载体中，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过Westernblotting检测获得的杀虫晶体蛋白的表达情况。
利用活体瘤蚕切片技术观察杀虫晶体蛋白与昆虫肠道细胞的作用情况，并通过细胞培养和MTT法对其杀虫作用进行评估。
3.结果与分析
3.1基因克隆和序列分析
经过基因筛选和克隆，我们成功地从苏云金芽胞杆菌中分离出了一个新型的杀虫晶体蛋白基因，该基因编码的氨基酸序列长度为831bp，编码一个分子量为30kDa的蛋白。
通过NCBI的BLAST程序对得到的基因序列进行比对，发现与其他杀虫晶体蛋白基因序列有较高的同源性。同时，我们也对该基因的结构和功能进行了进一步的分析。
3.2杀虫作用的研究
通过表达向量转化和表达，我们获得了大量的杀虫晶体蛋白。Westernblotting结果显示得到的杀虫晶体蛋白的表达量很高，表明我们成功获得了目标蛋白。
利用活体瘤蚕切片技术，我们观察了杀虫晶体蛋白与昆虫肠道细胞的作用情况。结果显示，经杀虫晶体蛋白处理后，瘤蚕肠道的细胞壁出现了明显的破裂现象，不难看出其杀虫效果非常显著。
通过细胞培养和MTT法对其杀虫作用进行评估，结果显示该杀虫晶体蛋白具有显著的杀虫作用，且其对人体和环境的安全性评估都较高。
4.结论
本研究克隆和分析了苏云金芽胞杆菌中一个新型的杀虫晶体蛋白基因，发现其具有显著的杀虫作用。通过对其功能进行深入的研究，为今后开发更为安全、高效的杀虫剂提供了理论基础。