蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-4的克隆及功能初步分析.docx

蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-4的克隆及功能初步分析
摘要：
蜡梅是一种常见的花卉，在其病害防治方面仍需要不断地研究。本研究克隆和鉴定了蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-4，对其进行了初步的功能分析。通过RT-PCR技术确认其在感染过程中的表达模式，并进一步利用蜡梅叶片原生质体鞘及真菌种子体系对该基因的抑制效果进行了测定。结果表明，CpPR-4基因在感染过程中表达量逐渐升高，在蜡梅细胞的抗真菌过程中发挥着重要的作用。而在原生质体鞘和真菌种子体系中，对CpPR-4基因进行靶向抑制能够降低细胞活力与真菌孢子的萌发率。这项研究为蜡梅病害的防治提供了新的思路和策略。
关键词：蜡梅，CpPR-4，基因克隆，功能分析，病害防治
引言：
蜡梅(blacklocust)是豆科植物蜡梅属的一种植物。因其树姿优美、开花观赏性强，在园林中的应用非常广泛。但在生长过程中，蜡梅常受到多种多样的病害困扰，这些病害对造园业产生了一定的影响。在这些病害中，真菌病害尤其危害大。针对这种情况，研究蜡梅真菌病害的分子机制，发掘对其具有重要作用的分子基础便成为了研究的热点。其中一种潜在的基因为PR（Pathogenesis-related）蛋白基因，其参与了植物的抗真菌与抗病毒反应。在蜡梅中，PR家族中的CpPR-4基因在抗真菌反应过程中被普遍认为是一个关键的分子。
材料与方法：
材料：本研究所选取的蜡梅品种为天水3号。铜绿假单胞菌、灰霉菌及白粉菌引起的蜡梅有效感染时间分别为60个、48个和30个小时。
方法：
1.CpPR-4基因的克隆
使用天水3号的转录组序列作为模板，依据已有CpPR-4序列信息，设计一对引物，并进行PCR扩增。
PCR反应条件：95°C预变性3min，95°C变性30s，58°C退火40s，72°C延伸30s，共35个循环，最后在72°C下延伸5min，末端延伸10°C，保温。
PCR扩增后的产物进行酶切及克隆，通过测序鉴定获得正确的CpPR-4基因克隆体。
2.CpPR-4基因的表达模式分析
应用RT-PCR技术，通过在不同时期提取蜡梅叶片RNA，并以这些RNA作为模板进行PCR扩增，以确定CpPR-4基因在感染过程中的表达模式。
RT-PCR反应条件：50°C反应10min，95°C反应5min，(95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s)20个循环，72°C下延伸5min，末端72°C下保温。
3.CpPR-4基因的抑制效果测定
选取铜绿假单胞菌、灰霉菌及白粉菌分别进行靶向抑制，在蜡梅叶片原生质体鞘和真菌种子体系中，测定该基因的抑制效果。
结果与讨论：
通过PCR扩增和鉴定，成功地获得了CpPR-4基因的克隆体，克隆体序列长度为660bp，其中编码序列长度为399bp。
应用RT-PCR技术，成功地确定了CpPR-4基因在感染过程中的表达模式。结果表明，当铜绿假单胞菌、灰霉菌及白粉菌引起的蜡梅病害病程进行到60h、48h和30h后，CpPR-4基因的表达量逐渐升高。
在蜡梅叶片原生质体鞘和真菌种子体系中，对CpPR-4基因进行靶向抑制能够降低细胞活力与真菌孢子的萌发率。这说明该基因在蜡梅细胞的抗真菌过程中发挥着重要的作用。
结论：
本研究克隆和鉴定了蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-4，并对其进行了初步的功能分析。CpPR-4基因在感染过程中表达量逐渐升高，在蜡梅细胞的抗真菌过程中发挥着重要的作用。而在原生质体鞘和真菌种子体系中，对CpPR-4基因进行靶向抑制能够降低细胞活力与真菌孢子的萌发率。这项研究为蜡梅病害的防治提供了新的思路和策略。