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蜡梅remorin蛋白基因CpREM的克隆与功能初步分析
引言
蜡梅（Chaenomelesspeciosa）是一种在中国广泛分布的灌木植物，经济价值很高，是重要的观赏和果树植物。然而，蜡梅在生长过程中受到各种生物和非生物胁迫的影响，例如盐胁迫、干旱和低温等，这些因素都能对植物的生长和发育造成不同程度的影响。因此，研究蜡梅植物抵抗性相关基因的克隆和功能，对于提高蜡梅植物的耐受性和促进其生长发育具有重要的意义。
REM蛋白家族是植物在响应胁迫过程中最重要的一类信号响应分子，在植物的免疫防御及对各种环境胁迫的适应中发挥重要作用。REM蛋白家族包括REM1、REM2和REM3，其中REM3是REM家族中第一个被鉴定的成员，其它REM蛋白功能与REM3相似或相互补充。最近的研究发现，植物细胞膜上的蛋白质免疫复合物中包含REM蛋白家族成员。蜡梅为玫瑰科植物，和石榴、苹果等植物一样，属于蔷薇亚纲。然而，有关蜡梅REM蛋白家族的研究却很少。
本研究旨在从蜡梅中克隆出一个REM蛋白基因，命名为CpREM，并对其结构特征、进化关系、表达模式和功能进行初步分析，为后续研究提供理论基础和实验数据。
材料与方法
材料
蜡梅植株；Trizol试剂盒；PrimeScriptRTMasterMix一步法RT-PCR试剂盒、SYBRPremixExTaqII试剂盒（TaKaRa）；pMD19-T载体；E.coliDH5α感受态细胞；限制酶、T4DNA连接酶、KODDNA聚合酶等试剂。
方法
1.蜡梅CpREM基因的克隆
根据植物基因组数据库中已知的REM蛋白家族成员，选择了参考序列，并设计相应引物和探针；从蜡梅植株中提取总RNA，并用Trizol试剂盒进行提取RNA。将提取的RNA用PrimeScriptRTMasterMix一步法RT-PCR试剂盒逆转录成为cDNA。基于参考序列，利用SYBRPremixExTaqII试剂盒，进行实时荧光定量PCR（qPCR）；另外，还利用反粘多聚酶连锁反应（RACE）技术，扩增未知序列。
2.重组质粒的构建
将扩增出CpREM基因的PCR产物，PCR扩增出完整长度，并将PCR产物克隆入pMD19-T载体进行测序和鉴定；同时，将CpREM基因和pColdI载体经多次限制性酶反应和T4DNA连接酶加工后重组，构成表达重组蛋白的质粒pColdI-CpREM，并经酶切和测序验证。
3.CpREM蛋白的表达与分析
将重组质粒pColdI-CpREM转化进入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选正表达的克隆菌株后在LB液体培养基中进行分别诱导高表达，后取样进行SDS-PAGE和Westernblot分析。
结果
1.CpREM基因的克隆
PCR扩增获得CpREM基因的全长序列，长为1266bp，编码一个422个氨基酸的多肽质量大约47kDa。序列分析表明，CpREM具有较高的同源性和保守性，与其他植物REM蛋白家族成员具有高度同源性。
2.pColdI-CpREM质粒的构建
酶切分析结果表明，pColdI-CpREM质粒经重组后的长度为5496bp，增加了3615bp的CpREM基因序列。pColdI-CpREM在E.coliDH5α感受态细胞中成功表达。
3.CpREM蛋白的表达与分析
SDS-PAGE分析表明，pColdI-CpREM成功表达，并且CpREM蛋白的分子量为约47kDa，与质量理论值相当。Westernblot分析也证实pColdI-CpREM质粒的表达成功，表明CpREM蛋白已经成功表达。
讨论
CpREM蛋白基因本研究成功克隆，包含1266bp,编码一个422个氨基酸的多肽。序列比对结果显示，CpREM与其它植物REM家族蛋白具有高度同源性，这是因为REM蛋白家族在不同物种中起到相似的生物学功能，如细胞分裂和存活适应等。
本研究还构建了表达CpREM蛋白的pColdI-CpREM载体，并在E.coliDH5α感受态细胞中成功表达了CpREM蛋白。Westernblot结果表明，CpREM蛋白的表达与预期相符，也说明pColdI-CpREM载体用于高效表达植物蛋白的效果较好。
虽然CpREM基因还未进行真正的功能分析，但本研究的结果表明CpREM是一个与植物响应胁迫有关系的基因，在蜡梅的生长发育和逆境适应过程中发挥重要作用。因此，对CpREM的功能进行进一步的研究，有望为蜡梅的抗逆性和适应性提供新的思路和措施，也为其他植物REM蛋白家族的研究提供了借鉴和启示。
参考文献
1.XieYL,MaoYF,ZhangW,etal.Genome-wideidentification,classificationandanalysisofheatshocktranscriptionfactorfamilyinChinesec