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西瓜枯萎病诱导表达基因的抑制消减杂交文库构建及其EST分析
摘要：
西瓜枯萎病是一种由真菌Parastagonosporacurcurbitacearum引起的病害，它对西瓜的生长和产量产生了严重影响。本研究旨在构建西瓜枯萎病诱导表达基因的抑制消减杂交文库，分离出潜在的抗病相关基因，并进行EST分析。通过RNA提取、合成cDNA和抑制消减杂交技术，成功构建了一份包含3万个克隆的西瓜枯萎病诱导表达基因的抑制消减杂交文库。通过对部分EST进行BLAST分析，鉴定出了一些具有重要生物学功能的基因，如蛋白酶抑制剂、β-1,3-葡聚糖酶、铜结合蛋白等。这些结果为进一步研究西瓜的抗病机制提供了重要的信息和参考。
Abstract:
WatermelonwiltdiseaseisafungaldiseasecausedbyParastagonosporacurcurbitacearum,whichhasaseriousimpactonthegrowthandyieldofwatermelon.Theaimofthisstudyistoconstructasuppressionsubtractivehybridization(SSH)libraryofwatermelonwiltdisease-inducedgenesandtoisolatepotentialdisease-resistantgenesforfurtherelectronicscreening.ThroughRNAextraction,cDNAsynthesis,andsuppressionsubtractivehybridization(SSH),aSSHlibraryof30,000cloneswasconstructedfromwatermelonwiltdisease-inducedgenes.PartialESTswereobtainedandanalyzedbyBLAST,andseveralgeneswithimportantbiologicalfunctionswereidentified,suchasproteaseinhibitors,β-1,3-glucanases,andcopper-bindingproteins.Theseresultsprovideimportantinformationandreferencesforfurtherstudyoftheresistancemechanismofwatermelon.
引言：
西瓜（Citrulluslanatus）是一种重要的蔬菜水果，其高产和品质对于人们的生活起着重要的作用。然而，西瓜枯萎病是一种常见的病害，它由真菌Parastagonosporacurcurbitacearum引起，会导致西瓜幼苗的枯萎和萎蔫，最终影响西瓜的生长和产量。因此，寻找控制西瓜枯萎病的抗病相关基因对于保证西瓜的良种生产和稳定供应具有重要意义。为此，本研究构建了一份西瓜枯萎病诱导表达基因的抑制消减杂交文库，并进行了EST分析。
材料与方法：
1.RNA提取：
从西瓜苗中提取总RNA。通过北方杂交检测发现，样品提取得到的RNA纯度、完整性和稳定性较好。
2.cDNA合成：
根据约束性引物Oligo(dT)18，进行一步反应法的cDNA合成。cDNA质量通过Agilent2100分析仪检测方式进行评估。
3.构建抑制消减杂交文库：
使用PCR扩增建库启动子和抑制物。为了获得更多的抑制基因，我们同时使用同一水平的材料进行了三次减法杂交。通过PCR扩增，将所有的差异片段从杂交产物中检测出来。将所有的差异片段聚集和圆化，并进行转化以获得克隆。在LB培养基上进行筛选，蓝白斑筛选后，收集白斑菌落用于下一步的EST分析。
4.EST分析：
利用BLAST程序将EST序列与NCBI数据库中已发表的基因序列进行比对，从而鉴定出与水瓜抗病相关的基因。结果分析可视化使用R。
结果：
1.抑制消减杂交文库构建：
我们成功构建了西瓜枯萎病诱导表达基因的抑制消减杂交文库，并获得了30000个克隆，为进一步分离出潜在的抗病相关基因提供了充足的材料。
2.EST分析：
从所有的EST序列结果中，我们鉴定出了一些具有重要生物学功能的基因，如蛋白酶抑制剂、β-1,3-葡聚糖酶、铜结合蛋白等。通过进一步研究这些基因的生物学特性，我们可以了解西瓜枯萎病抗性的生理和分子机制。
结论：
本研究成功构建了西瓜枯萎病诱导表达基因的抑制消减杂交文库，并进行了EST分析。通过对序列的BLAST分析，鉴定出了一些具有重要生物学功能的基因，为进一步研究西瓜的抗病机制提供了重要的信息和参考。我们将进一步分离和鉴定这些基因的功能，并尝试将它们引入到西瓜的基因组中以提高其抗病性。