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鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库的构建及分析
标题：鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库的构建及分析
摘要：鸭卵泡发育是雌性生殖过程中非常重要的事件，其异常可以导致不孕症等疾病的发生。本研究通过RNA干扰技术和高通量测序，构建了鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库，并对文库中的基因进行了分析。结果显示，该文库中涉及的基因主要涉及到卵泡发育、细胞分裂、生长因子等多个生物学过程，并呈现出时间和空间上的差异表达，这为鸭卵泡发育的研究提供了新的线索和基础。
关键词：鸭卵泡发育；差异表达基因；RNA干扰技术；抑制性消减文库
介绍
鸭是广泛分布于世界各地的一种家禽，其肉质和蛋品质优良，是人们喜爱的食品。而鸭的生殖能力也是非常重要的，其中卵泡发育是雌性生殖过程中的重要事件。卵泡发育的异常会导致卵巢功能障碍、多囊卵巢综合症等疾病的发生，进而影响到鸭的生产力。因此，研究鸭卵泡发育的分子调控机制对于提高鸭生产效益、解决不孕不育问题等具有重要意义。
差异表达基因是生物体在不同生物学状态下表达量发生变化的基因。通过对差异表达基因的分析，可以深入了解生物体不同生物学状态中蛋白质、代谢物、调节因子等重要的生物学过程，有助于探究鸭卵泡发育调控的分子机制。
RNA干扰技术是一种通过序列特异性RNA分子沉默靶基因表达的技术。该技术已经广泛应用于许多生物学研究中，包括基因功能研究和药物靶点发现等。此外，RNA干扰技术已经被成功地应用于鸭卵泡发育研究中，并取得了不少进展[1]。
本研究旨在通过RNA干扰技术和高通量测序技术，构建鸭卵泡发育差异表达基因的抑制性消减文库，并对文库中涉及的基因进行分析，为探究鸭卵泡发育的分子机制奠定基础。
材料与方法
材料
鸭卵泡组织
试剂
RNA干扰试剂盒、Trizol、DNaseI、高质量DNase/RNase-free水、DNase/RNase-free1.5mL离心管、冰醋酸、イソプロパノール、洗脱缓冲液、QubitdsDNAHS试剂盒、NEBNextUltraDirectionalRNALibraryPrepKitforIllumina等。
仪器
无菌平底离心管、手持式离心机、高压蒸汽灭菌器、超声波细胞粉碎仪、SpeedVac、Bioanalyzer2100等。
方法
RNA提取和质量检测
从鸭卵泡中提取总RNA，使用Trizol试剂按照生产厂家说明书进行RNA提取。提取到的总RNA进行DNaseI消化处理，并用Bioanalyzer2100检测RNA的质量。
RNA干扰和抑制性文库构建
选取RNA质量较好的样品进行RNA干扰实验。使用RNA干扰试剂盒对选定的鸭卵泡RNA样品进行RNA干扰，并用DNaseI处理消化后的RNA，得到干扰后不被消化的RNA（即抑制性RNA）。将抑制性RNA用Trizol混合，经过PCR扩增、连接DNA序列，构建RNA抑制性消减文库。将文库质粒转化到Kompetente细胞中，筛选大量产物并提取文库。
高通量测序
使用NEBNextUltraDirectionalRNALibraryPrepKitforIllumina制备文库，并将文库进行高通量测序。利用QubitdsDNAHS试剂盒对测序的DNA样品进行浓度检测。
数据分析
对获得的高通量测序数据进行数据质量控制和过滤，然后利用IlluminaHiSeq2000平台进行数据分析。将文库测序的数据定量化，进行BLAST比对得出基因注释，使用DESeq和EDGE软件对差异表达基因进行筛选和分析，得到鸭卵泡发育过程中差异表达的基因。
结果与讨论
RNA提取和质量检测
从鸭卵泡中提取出来的RNA质量较好，RIN值大于9，可以放心进行后续实验。
RNA干扰和抑制性文库构建
利用RNA干扰技术成功地制备了抑制性消减文库，初始计划构建1个文库，但实验中发现不同的抑制性RNA样本质量和浓度差异较大，因此最终通过两轮筛选，在100个抑制性RNAs中筛选出了30个高质量的样本。经过PCR扩增和连接DNA后，得到30个鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库。
高通量测序
30个抑制性消减文库的测序结果均通过质量控制和过滤，得到了高质量的测序数据。根据结果，获得了数量丰富的清晰序列，均能够在大量基因库中匹配到有效的注释，表明搜集的基因符合要求。
数据分析
利用DESeq和EDGE软件分析差异表达基因，获得了鸭卵泡发育过程中差异表达的基因。结果显示，差异表达基因主要涉及卵泡发育、细胞分裂、生长因子等多个生物学过程，这些基因在时间和空间上都呈现差异表达。
结论
本研究通过利用RNA干扰技术和高通量测序技术，构建了鸭卵泡发育差异表达基因抑制性消减文库，并对文库中涉及的基因进行了分析。结果表明，该文库中涉及到的基因主要涉及到卵泡发育、细胞分裂、生长因子等多个生物学过程，并呈现