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纳米载体介导小干扰RNA沉默Bmi-1基因对乳腺癌MCF-7细胞的影响
引言
乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是女性的主要健康威胁之一。目前，传统的治疗手段包括手术、放疗、化疗和内分泌治疗等，但是这些治疗方式在一定程度上限制了治疗效果和患者的生活质量。因此，诱导生物小干扰RNA(siRNA)沉默癌基因已成为癌症治疗领域的一种新策略。
乳腺癌的进展和转移可能与许多调节因子有关，其中Bmi-1是一个高度保守的多肽基因，被证明在多种肿瘤中有过表达。研究表明，Bmi-1在乳腺癌细胞的细胞周期、生长和转移中都扮演着重要的角色，因此它已成为潜在的抗肿瘤靶点。siRNA介导Bmi-1基因靶向沉默可能成为治疗乳腺癌的有前途的策略。
在过去的几年中，纳米技术已被广泛地用于传递siRNA。纳米载体可以通过结构稳定性、靶向性、耐受性、生物活性和药物耐受性等方面优化siRNA的输送。因此，纳米载体介导siRNA沉默成为了一种有效的靶向治疗策略。
在本文中，我们将探讨纳米载体介导的小干扰RNA沉默Bmi-1基因对乳腺癌MCF-7细胞生长和转移的影响。
材料与方法
细胞系
我们选择了MCF-7乳腺癌细胞系作为研究对象。MCF-7细胞系是人类乳腺癌最常用的研究模型之一，可以在无血清的培养条件下进行长期培养。
siRNA序列
我们针对Bmi-1基因设计了三个小干扰RNA序列：siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3。siRNA序列如下：
siRNA-1:GAGAGUGGCACACAGCAAU
siRNA-2:AGGACACAAGGAAACCGAA
siRNA-3:UCAUUGCAAUGGCACCAGA
细胞病理学
我们使用细胞病理学检测了siRNA纳米载体的转染效果。MCF-7细胞在六孔板中定植，并在转染前在37°C和5%CO2条件下孵育24小时。然后，我们使用不同浓度的纳米载体转染siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3，分别为0.1，0.25，0.5，0.75和1.0μg/ml。细胞在转染后24小时顺便施加荧光激活细胞分类。
Real-timePCR检测Bmi-1基因的表达
我们使用实时PCR检测了siRNA纳米载体转染后Bmi-1基因的mRNA表达水平。MCF-7细胞分别接受siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3的特异性恢复。您可以使用TRIzol方法从细胞中收集总RNA。我们取总RNA的200ng，使用MMLV逆转录酶逆转录，并用SYBRGreen探针在ABIPrism7500复合物中分析PCR产物的特异性。乳酸脱氢酶（LDH）的同步进行被用来标准化检测结果。
细胞增殖分析
我们使用MTT分析了不同siRNA序列介导的Bmi-1基因的沉默对MCF-7细胞增殖的影响。MCF-7细胞在96孔板中定植，并在转染前在37°C和5%CO2条件下孵育24小时。然后，我们用不同浓度的纳米载体转染siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3，分别为0.1、0.25、0.5、0.75和1.0μg/ml。每个组放置后，细胞再44-48小时的培养后进行测定，具体方法可以参考我们之前发表的工作（XXXXX）。
细胞周期分析
我们使用流式细胞术分析了siRNA纳米载体介导的Bmi-1基因沉默对MCF-7细胞周期的影响。转染后，MCF-7细胞用PBS洗一遍，分散在95%的乙醇中并放置在4°C中一晚上以固定代谢。细胞离心以去除乙醇并重悬在PBS中（含0.05%胰蛋白酶和0.2%TritonX-100除菌）。然后，我们使用蓝色荧光素B/PI双标记方法标记DNA含量，并用FACScalibur流式细胞分析机进行检测。验抗体系统中所有的药品，丙酮，试验设备及指南都遵循XXXX中的规范。
转移分析
我们使用Matrigel转移实验检测了siRNA纳米载体介导的Bmi-1基因沉默对MCF-7细胞转移的影响。转染2天后，我们选择使细胞吞噬物的数目相等并将它们置于用Matrigel包裹的Transwell膜上。上层腔体中含有无血清DMEM培养基，而下层腔体中包含了10%FBS。细胞再32-44小时培养后进行测定，具体方法可以参考我们之前发表的工作（XXXXX）。
结果
siRNA纳米载体的转染效果
我们使用细胞病理学检测了不同浓度的纳米载体介导siRNA-1,siRNA-2和siRNA-3对MCF-7细胞的转染效果。结果显示，纳米载体在0.25μg/ml浓度下可以有效地传递siRNA。因此，我们在接下来的实验中选择了0.25μg/ml的浓度。
Bmi-1基因的表达水平
我们使用实时PCR检测了Bmi-1基因转染的siRNA-1,siRNA-2和siRNA-3的沉默效果。结果显示，siRNA-1可以成功地沉默Bmi-1基因，而siRNA-2和siRNA-3的沉默效果不尽