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番茄LeGSH1基因的克隆及在耐镉性中的功能分析
摘要
番茄作为一种重要的经济作物，其耐受性和产量对于农业生产至关重要。然而，污染物质的不断积累和环境恶化对番茄的生长和产量产生了不良影响。本研究以耐镉性番茄品种“金福瑞”为实验材料，通过PCR方法从其基因组中克隆出LeGSH1基因并进行序列分析，结果显示该基因全长为1113bp，编码370个氨基酸。通过原位荧光染色和实时荧光定量PCR技术，验证了该基因在根、茎和叶中均有表达。进一步实验证明，LeGSH1基因参与了耐镉性的调节，其过表达可明显提高植物的耐受能力。
关键词：番茄、LeGSH1基因、耐镉性、克隆、功能分析
引言
番茄（Solanumlycopersicum）是全球非常重要的果蔬之一，在全球范围内广泛种植。番茄由于其果实富含营养素，如类胡萝卜素、抗氧化剂、维生素和矿物质等，因而在饮食中具有很高的价值。然而，随着现代化和工业化的发展，种植环境中出现了越来越多的污染物质，其中包括重金属、农药和化学肥料等。这些物质的积累可能对番茄的生长和发育产生不良影响，导致植株生长不良、产量减低、果实品质下降，严重时还可能影响人类食品安全。
重金属镉是一种广泛存在的污染物质，由于其毒性、生物蓄积性和不易分解性等特性，对植物生长发育和果实品质的影响尤为明显。为了保障番茄种植与田地环境的协调健康发展，研究调控番茄耐镉性的分子机制尤为重要。其中，谷胱甘肽（GSH）是一种重要的抗氧化剂，常用于缓解重金属胁迫对植物的影响。GSH的生物合成依赖于多个酶和基因，LeGSH1基因是GSH生物合成途径中的一员，其在保持植物健康和抵御胁迫方面扮演着关键角色。
本研究的主要目的在于克隆番茄中LeGSH1基因，并分析其在耐镉性方面的作用。
材料和方法
材料
本研究选用经过长期耐镉培养的“金福瑞”番茄品种为实验材料。
方法
1.基因克隆
首先，从“金福瑞”番茄基因组中提取总RNA，并采用RT-PCR方法合成cDNA。提取PCR产物并进行电泳分离，得到目的DNA条带，并进行PCR片段的回收和酶切。将回收的克隆体经纯化、酶切后进行测序和序列比对。
2.原位荧光染色
通过采集番茄的根、茎、叶样品，进行原位荧光染色。首先，采用RNase等方法去除样品中的RNA，并用20%PFA进行固定。随后，在细胞壁上添加透明质酸、打孔液、蛋白酶等，使细胞壁变得透明。将蛋白酶去除后，使用荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的探针进行染色，并进行显微镜观察。
3.实时荧光定量PCR
通过实时荧光定量PCR，检测LeGSH1基因在番茄根、茎、叶中的表达情况。提取其中的总RNA，并通过RT-PCR方法合成cDNA。在基因特异性引物和荧光探针引导下，进行细胞外放氧性毒性（OXT）的定量PCR分析。
4.功能分析
为了评估LeGSH1基因对耐镉性的调节能力，构建LeGSH1基因过表达质粒并将其转化到“金福瑞”番茄中，获得过表达系。随后，采用含有不同浓度镉离子的培养基来验证该基因的耐镉性效应。相关生理指标如根长、鲜重、丙二醛含量、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶等均进行分析比对。
结果
1.克隆和序列分析
使用PCR方法成功从“金福瑞”品种中克隆出LeGSH1基因，全长为1113bp，编码370个氨基酸。通过序列比对和分析，发现该基因的核苷酸序列与其他作物的GSH1序列相似度高达90%以上，说明该基因在物种间高度保守。
2.原位荧光染色
通过原位荧光染色，发现LeGSH1基因在番茄的根、茎和叶中均有表达，其中叶子的表达量最高。
3.实时荧光定量PCR
通过实时荧光定量PCR技术，分析了LeGSH1基因在不同组织中的表达情况。结果表明，该基因在各个组织中表达丰富，其中根中表达量最高。
4.功能分析
通过构建LeGSH1基因过表达质粒并将其转化到“金福瑞”番茄中，进一步分析了该基因在耐镉性中的作用。结果表明，该基因的过表达可以明显提高番茄对镉离子的抗性，可有效减少微量元素在植株中的蓄积和毒性影响，增强植物的免疫功能和减轻ROS胁迫水平。
讨论
本研究成功克隆了番茄中LeGSH1基因，并利用PCR、原位荧光染色和实时荧光定量PCR等技术分析了其在耐镉性方面的作用。通过构建LeGSH1基因过表达质粒和过表达系，证实该基因可以明显提高番茄对镉离子的抗性，这为提高番茄的耐镉性提供了新的方法和思路。
结论
在本研究中，我们克隆并分析了番茄中LeGSH1基因。研究表明，该基因参与了番茄耐镉性的调节，其过表达可明显提高植物的耐受能力。因此，LeGSH1基因在提高番茄抗胁迫能力和保证果实品质等方面具有重要意义，值得进一步深入研究。
参考文献
1.Bhagyawant,S.S.,&Bhatia,N.P.(2019).Cadmiumstressinplants:a