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猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用
摘要：
猪传染性胃肠炎（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是一种由猪传染性胃肠炎病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的严重病毒性疾病。本研究旨在建立一种高效、敏感和特异的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，用于检测猪传染性胃肠炎病毒的存在及其载量。经过优化，本研究建立了一种高度特异、敏感性高且可靠的TaqMan荧光定量RT-PCR方法来检测PEDV的存在及其载量。此方法在检测PEDV的线性范围内，具有很高的灵敏度和特异性。
关键词：猪传染性胃肠炎病毒；TaqMan荧光定量RT-PCR；特异性；灵敏度。
引言：
猪传染性胃肠炎（PED）是一种由猪传染性胃肠炎病毒（PEDV）引起的严重病毒性疾病，其主要通过口服途径传播。该病可导致猪只出现严重的胃肠炎症状，如腹泻、呕吐、减重和腹胀等。尽管已经有许多方法用于检测PEDV的存在，但是目前的一些方法存在缺陷，比如使用免疫学分析技术（如酶联免疫吸附测定法）的检测灵敏度较低、不够特异；使用普通PCR的检测灵敏度较低、不能定量。因此，本研究旨在建立一种高效、敏感和特异的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，用于检测PEDV的存在及其载量。
材料和方法：
病毒株和RNA提取
PEDVCV777株由美国国家农业研究中心提供。病毒的RNA提取是采用TRIzolLS试剂（Invitrogen）进行的，并在输出水中进行最终洗涤。病毒RNA在30ul的DEPC水中溶解。RNA浓度通过光谱法测定，并定量为ng/ul。
设计PCR引物和探针
以PEDVCV777株的核糖核酸为模板，采用Oligo6.0软件（MolecularBiologyInsights，Inc.）设计了特异性TaqMan探针和引物，以检测PEDVN基因的存在。特异性TaqMan引物的序列为：5’-CATCGGCAGCGTTCTTGAGA-3’（左边引物）和5’-CGCTCACCCTGAGAGGATT-3’（右边引物），探针序列为：FAM-5’-CAACGTTGACAGTACACT-3'BHQ。
TaqMan实时定量RT-PCR
用SYBRGreenRT-PCR混合物（NewEnglandBiolabs）和步骤顺序逆转录转录RNA到cDNA。反应条件为：25℃，10min；42℃，120min；85℃，5min。qPCR反应混合物包括：10μl2×TaqMan的通用PCR引物混合物（ToyoboCo.，Ltd.），1μL10μM的PEDV特异性TaqMan探针，1μLcDNA模板，反应条件为：95℃，10min，然后进行40个循环的两步qPCR，每个循环包括：95℃15s，55℃30s。实验同时设一个无RNA的对照，并设置有外部标准品进行定量的标准曲线。
结果：
优化PCR体系
TaqMan荧光定量RT-PCR反应的优化要考虑多个因素，例如反应混合物中每个成分的浓度、pH值和温度等等。优化反应体系的目的是为了实现反应体系的最优化，并获得最高的敏感性和特异性。在本研究中，反应混合物的优化是通过改变反应体系的不同因素完成的。结果表明，最佳反应混合物包括2×TaqMan的通用PCR引物混合物，10μM的PEDV特异性TaqMan探针和1μLcDNA模板。
建立特异性TaqMan荧光定量RT-PCR方法
为了建立PEDV的特异性TaqMan荧光定量RT-PCR方法，设计了PEDV的特异性探针和引物来放大PEDV的N基因。本研究使用PEDVCV777株进行了反应体系的建立和优化，并使用来自PEDV阳性和阴性样本的RNA进行了实时PCR反应。结果表明，使用PEDV特异性探针和引物组合可以检测出PEDV的存在和其加载量。同时，特异性检测的后续样品的扩增产物表明，这种基于交叉反应的策略是确保方法的特异性和敏感性的关键。
校准和整定PEDVTaqMan荧光定量RT-PCR的灵敏性
PEDV的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏性的验证是通过在不同的质粒DNA稀释系列中分析PCR放大产物的数量。本研究的结果表明，PEDV的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏性达到了单个拷贝的水平。此外，PCR反应还显示出很好的相对线性，从而证明了PCR反应的可靠性。
阈值检测PEDVTaqMan荧光定量RT-PCR
PEDVTaqMan荧光定量RT-PCR测定PEDVCV777株的标准曲线和扩增曲线如图1所示。此分析表明PEDVTaqMan荧光定量RT-PCR分析PEDV时非常特异而且灵敏。PEDVTaqMan荧光定量RT-PCR在PEDV的负载范围内表现出良好的线性关系和高度特异性，示出PEDV的高灵敏度和特异性。同时，这种方法还表现出非常