犬α7干扰素在大肠杆菌与毕赤酵母中的活性表达及分析.docx

犬α7干扰素在大肠杆菌与毕赤酵母中的活性表达及分析
犬α7干扰素在大肠杆菌与毕赤酵母中的活性表达及分析
摘要：犬α7干扰素是一种重要的免疫调节因子，在免疫反应、抗病毒等方面具有广泛的应用价值。本研究以大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母PichiapastorisGS115作为表达宿主，构建重组质粒并进行犬α7干扰素在这两个系统中的表达，随后对表达产物进行纯化和活性鉴定。结果表明，在大肠杆菌系统中，犬α7干扰素的表达量较高，但是表达产物仅具有部分活性；而在毕赤酵母系统中，虽然表达量相对较低，但是表达产物具有较高的活性。本研究为深入研究犬α7干扰素的生物学功能及其应用价值提供了基础研究支持。
关键词：犬α7干扰素；大肠杆菌；毕赤酵母；表达；活性鉴定
Introduction
犬α7干扰素（Canineα7interferon）是一种与病毒感染等刺激有关的免疫调节因子，属于免疫球蛋白家族。犬α7干扰素在细胞免疫和体液免疫方面具有很重要的作用，能够促进天然免疫细胞增殖、激活和细胞因子的分泌等。目前，犬α7干扰素已广泛应用于免疫调控、抗病毒等方面，但是其大规模生产及纯化等技术难题一直是限制其应用的瓶颈。因此，研究犬α7干扰素的表达及其活性的鉴定对于深入研究其生物学功能，以及推广其在临床应用中的必要性非常迫切。
目前，常用的犬α7干扰素的表达宿主包括大肠杆菌和毕赤酵母等。本研究旨在探讨犬α7干扰素在这两个系统中的表达量及其表达产物的活性，为其大规模生产及应用提供技术支持。
MaterialsandMethods
构建重组质粒
以犬α7干扰素基因序列为模板，采用PCR扩增该全长基因。随后，将扩增产物连接到表达载体质粒pET-28a和pPICZαA中，分别得到含有犬α7干扰素基因的pET-28a-α7和pPICZαA-α7质粒。将两个重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母PichiapastorisGS115中。
表达重组蛋白
在大肠杆菌系统中，用IPTG在37℃条件下诱导蛋白表达，形成包涵体。将表达产物经过裂解、纯化等步骤后得到表达产物。在毕赤酵母系统中，用MeOH诱导蛋白表达，利用Pichiapastoris自身的信号肽剪切酶对表达产物进行分泌。将分泌产物收集、浓缩、纯化等步骤后得到表达产物。
活性鉴定
对表达产物的活性进行鉴定。在大肠杆菌系统中，用SDS-PAGE等方法检测表达产品，采用酶活性测定等方法检测表达产物的活性；在毕赤酵母系统中，用ELISA等方法检测表达产物发挥的免疫调节作用等。
Results
构建重组质粒
成功构建了含有犬α7干扰素基因的pET-28a-α7和pPICZαA-α7重组质粒，经测序确认，无误。
表达重组蛋白
在大肠杆菌系统中，成功表达了包涵体型的犬α7干扰素。经过包涵体裂解、离心、纯化等步骤，得到了相关表达产物。在毕赤酵母系统中，成功表达了分泌型的犬α7干扰素，收集分泌产物后通过浓缩和纯化步骤得到了表达产物。经SDS-PAGE等方法检测发现，表达产物的分子量符合预期，表达量也相对较高。
活性鉴定
在大肠杆菌系统中，犬α7干扰素的酶活性测定结果显示，表达产物仅具有部分活性。而在毕赤酵母系统中，采用ELISA等方法检测发现表达产物具有非常高的免疫调节活性。
Discussion
本研究利用大肠杆菌和毕赤酵母两个常用的重组蛋白表达系统，成功构建了含有犬α7干扰素基因的质粒，并对表达产物进行了纯化和活性鉴定。研究发现，犬α7干扰素在大肠杆菌系统中表达量相对较高，但是表达产物仅具有部分酶活性；而在毕赤酵母系统中表达量相对较低，但是表达产物具有非常高的活性。
总结来说，本研究为深入研究犬α7干扰素的生物学功能及其应用价值提供了基础研究支持。在试验中，大肠杆菌系统和毕赤酵母系统都可以成功表达犬α7干扰素，并在一定程度上发挥其生物学功能，但是两个系统的表达量和活性有所不同。因此，针对不同应用领域的需要，可以选择不同表达系统，并对其表达产物进行相应的活性鉴定和纯化。