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牛蒡子苷元对肝癌SMMC-7721细胞侵袭、转移及血管生成的影响
摘要：
目的：探究牛蒡子苷元对肝癌SMMC-7721细胞侵袭、转移及血管生成的影响，为其应用提供理论依据。
方法：采用细胞实验，对肝癌SMMC-7721细胞进行不同浓度的牛蒡子苷元处理。利用Transwell实验、划痕实验、westernblot、realtimePCR、免疫荧光染色和管翼挂滴等方法，研究牛蒡子苷元对SMMC-7721细胞侵袭、转移及血管生成的影响。
结果：牛蒡子苷元处理能显著降低SMMC-7721细胞侵袭和迁移的能力，且降低SMMC-7721细胞的内皮细胞标志(vWF)、与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)相关的蛋白(vimentin和Snail)的表达。同时，牛蒡子苷元处理还能显著降低SMMC-7721细胞血管生成的能力，降低VEGF的表达。
结论：牛蒡子苷元能够抑制肝癌SMMC-7721细胞的侵袭、转移及血管生成，且可能通过抑制EMT参与其中。
关键词：牛蒡子苷元；肝癌；侵袭；转移；血管生成
Introduction:
肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其具有高度的转移和血管生成能力，导致高死亡率。因此，急需寻找有效的治疗方法。研究表明，天然植物化合物可以干扰癌细胞的转移和血管生成，因此，寻找具有抑制肝癌细胞转移和血管生成能力的天然植物物质非常重要。牛蒡子苷元是从牛蒡子中提取的一种化合物，被认为具有多种抗癌作用。本研究旨在探究牛蒡子苷元对肝癌SMMC-7721细胞侵袭、转移及血管生成的影响。
MaterialsandMethods:
细胞和试剂
肝癌细胞SMMC-7721细胞系由中国科学院细胞库获得。牛蒡子苷元质量为PC>98%（紫外光谱检测法），来源于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
细胞培养和牛蒡子苷元处理
SMMC-7721细胞系维持在DMEM培养液中，含10%的胎牛血清(Bovineserum，FBS)，1%的青霉素和链霉素。在初期细胞培养和处理之后，用牛蒡子苷元（0、5、10和20μM）处理SMMC-7721细胞。等待牛蒡子苷元治疗6小时后，细胞收集并用于后续实验。
Transwell迁移试验
将细胞悬浮液调为形成可聚落，加入血清不含的DMEM培养液中，将100μL的混合物分别加入Transwell的上室(8-μm滤网大小,CorningInc.,Corning,NY,USA)，下室加入500μL的DMEM培养液含有10%胎牛血清和0.5%青霉素和链霉素，保持在37°C,5%CO2处理6小时，然后将SMMC-7721细胞的迁移数目计数。
划痕实验
将牛蒡子苷元处理后的SMMC-7721细胞移植到6孔板上，细胞到达80%的密度，用1毫升的普通吸头在细胞内留下一道宽度约为1mm的划痕，用PBS洗涤细胞两次，用DMEM培养液进行培养，拍照并记录24小时划痕的缩小程度。
Westernblot分析
使用细胞裂解液洗涤SMMC-7721细胞，回收蛋白质并用BSA测定蛋白质的浓度。40μg的蛋白质被用于SDS-PAGE，然后蛋白质被转移到聚丙烯腈(PVDF)膜上。PVDF膜用5%的脂肪奶粉氯化物在室温下阻止非特异性的蛋白质结合，然后用TBS+0.1%Tween20(TBST)的缓冲液，对PVDF膜上的靶标进行孵育和识别。
Real-timePCR分析
从牛蒡子苷元处理后的细胞中提取总RNA，提取的RNA被反转录，然后进行分析和定量。PCR反应条件如下：1个循环95°C10分钟，45次45°C15秒，43°C1分钟，最后一个循环72°C1分钟，20°C保持静止状态。
免疫荧光染色
用冷PBS洗去牛蒡子苷元处理的细胞上的培养基，熔融PFA固定SMMC-7721细胞，处理细胞芯片中的180μL5%牛血清和0.3%Tx-100在室温下静置1小时，然后使用特定的抗体孵育SMMC-7721细胞。
管翼挂滴
在小型试管中加入牛蒡子苷元浓度不同的SMMC-7721细胞，将试管放置在显微镜下，记录24小时内血管生成的情况。
结果：
牛蒡子苷元处理降低了SMMC-7721细胞的侵袭和迁移能力，降低了与EMT和血管生成相关的蛋白质(vWF，vimentin和Snail)的表达和VEGF的表达。
结论：
牛蒡子苷元具有抑制肝癌细胞侵袭、转移及血管生成的能力，这一效果可能与其抑制EMT参与相关。这为其在肝癌治疗中的应用提供了重要的理论依据。