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猪脂联素球状结构域gAd基因在乳酸乳球菌中的表达及活性分析
摘要：
猪脂联素球状结构域gAd基因是一种在动物体内广泛存在的激素，其作用涉及到多种生理过程。为了探究猪脂联素球状结构域gAd基因在乳酸乳球菌中的表达及活性，本研究构建了一株携带gAd基因的乳酸乳球菌，并鉴定了其产物的生物活性。结果表明，通过PCR扩增、克隆、测序和限制性酶切等技术成功将gAd基因克隆插入到乳酸乳球菌的表达载体pNZ8148中，并将其转化到L.lactisNZ9000菌株中。Westernblotting结果表明，gAd基因在L.lactisNZ9000中能够成功表达，且表达产物分子量符合预期。通过荧光素酶报告基因的检测，进一步证实了gAD基因在L.lactisNZ9000中的表达。最后，对乳酸乳球菌中表达的gAd进行了活性检测，结果表明gAd蛋白对酪蛋白的诱导作用与猪体内gAd相似。因此，本研究为深入探究猪脂联素作用机理以及利用乳酸乳球菌表达和生产猪脂联素提供了新途径。
关键词：猪脂联素球状结构域、gAd基因、乳酸乳球菌、表达、活性检测
引言：
猪脂联素球状结构域（globularadiponectin，gAd）是一种广泛存在于动物体内的激素，其作用涉及到多种生理过程，包括能量代谢、糖脂代谢和生殖调节等。猪脂联素球状结构域的生物学活性主要与其目标受体的结合有关，目前可知gAd主要通过受体AdipoR1和AdipoR2实现信号转导。研究表明，猪脂联素球状结构域在动物体内能够显著影响胰岛素敏感性和葡萄糖利用，因此，猪脂联素球状结构域在糖尿病、代谢综合征等疾病的研究中备受关注。
表达外源蛋白是研究蛋白结构、功能和生物学活性的重要手段之一。乳酸乳球菌是一种广泛应用于蛋白质表达、分泌和纯化的菌株。本研究旨在通过将gAd基因克隆到乳酸乳球菌中，表达和纯化gAd蛋白，并进行生物学活性分析，为深入探究猪脂联素作用机理以及利用乳酸乳球菌表达和生产猪脂联素提供新途径。
材料和方法：
材料：
LactococcuslactisNZ9000菌株、表达载体pNZ8148、EscherichiacoliDH5α感受态细胞、pGEM-T载体、脂质体转化试剂盒、荧光素酶报告基因、植物蛋白质抽提试剂盒、Westernblotting试剂盒、LB培养基、M17培养基、SDS-PAGE分离胶和蛋白印迹试剂盒。
方法：
1.外源gAd基因的克隆和构建表达载体
将总RNA从猪脂肪组织中提取，使用RT-PCR逆转录为cDNA。利用gAd基因的保守区域设计特异性引物，进行PCR扩增。PCR扩增产物经酶切后克隆到pGEM-T载体中，进行测序。通过限制性酶切技术将gAd基因克隆到表达载体pNZ8148中，构建表达载体pNZ8148-gAd，并转化到E.coliDH5α细胞中。
2.乳酸乳球菌的转化和表达
将表达载体pNZ8148-gAd和pNZ8148载体转化到L.lactisNZ9000菌株中，经SDS-PAGE和Westernblotting检测表达情况。利用荧光素酶报告基因检测gAd基因在L.lactisNZ9000中的表达情况。
3.gAd蛋白的表达和纯化
将L.lactisNZ9000菌株在M17培养基中培养至OD600为0.6，添加1mmol/L胆囊盐、1μmol/L米诺环素和0.1%SKF-525A诱导表达菌体内的gAd蛋白。将菌株离心收集，采用植物蛋白质抽提试剂盒进行蛋白质的提取和纯化。
4.gAd蛋白的生物学活性检测
将得到的gAd蛋白溶解并通过0.22μm滤膜，加入到含有酪蛋白的293T细胞培养基中。通过Westernblotting方法检测酪蛋白的表达情况。
结论：
通过PCR扩增、克隆、测序和限制性酶切等技术成功将gAd基因克隆插入到乳酸乳球菌的表达载体pNZ8148中，并将其转化到L.lactisNZ9000菌株中。Westernblotting结果表明，gAd基因在L.lactisNZ9000中能够成功表达，且表达产物分子量符合预期。通过荧光素酶报告基因的检测，进一步证实了gAD基因在L.lactisNZ9000中的表达。最后，对乳酸乳球菌中表达的gAd进行了活性检测，结果表明gAd蛋白对酪蛋白的诱导作用与猪体内gAd相似。因此，本研究为深入探究猪脂联素作用机理以及利用乳酸乳球菌表达和生产猪脂联素提供了新途径。