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狂犬病病毒核蛋白基因的修饰、表达及其单克隆抗体的制备
狂犬病是由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RABV）引起的致命病毒性感染病，主要通过犬、猫等家畜的咬伤传播，但也可通过其他哺乳动物咬伤和唾液污染导致传播。近年来，虽然通过疫苗的普及和做好预防工作，狂犬病的流行率已经大大降低，但是仍然存在某些地区或国家的狂犬病流行问题，给人类健康带来的威胁依然不容忽视。因此，研究和开发针对狂犬病病毒的理念性和应用性的技术，是我们控制和预防狂犬病流行的有效手段之一。
本文将从狂犬病病毒的结构和感染机制入手，探讨狂犬病病毒核蛋白基因的修饰、表达及其单克隆抗体的制备的原理和研究进展。
1.狂犬病病毒的结构和感染机制
狂犬病病毒是一种具有负单链RNA病毒的病原体，其外壳由糖蛋白组成，内在核壳由衣壳蛋白和核酸包裹而成。它有5种基因，分别编码核酸蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）、衣壳蛋白（M）和溶原蛋白（G）。其中M和G蛋白被认为与宿主细胞的识别和结合有关，是狂犬病病毒的捆绑和入侵部分，L蛋白是狂犬病病毒的RNA依赖性RNA聚合酶，核酸蛋白（N）和磷蛋白（P）被认为与V-RNA复制和包装有关。
狂犬病病毒通过伤口、破皮等损伤处进入体内，到达神经末梢后，再从神经末梢进入神经元，沿着周缘神经系统向中枢神经系统侵入，最终损害大脑和脊髓，造成病理性改变。
2.狂犬病病毒核蛋白基因的修饰及表达
狂犬病病毒核蛋白基因编码狂犬病病毒的核酸蛋白（N），它与病毒的RNA基因相结合，形成铁棒状的核心外壳。因此，核蛋白是狂犬病病毒RNA的唯一外壳蛋白，在狂犬病病毒的生命周期中起着重要作用。
对于狂犬病病毒核蛋白基因的修饰，已经有许多报道。文献显示，利用反向遗传学方法，在核糖体绑定位点上插入或删除3个核苷酸，可以得到狂犬病病毒核蛋白的重组表达。例如，Snyderetal.利用这种方法，将核糖体绑定位点替换为启动子序列，驱动T7RNA聚合酶启动子表达，获得了狂犬病病毒核蛋白的表达。
除此之外，还有研究通过基因重排方式得到了狂犬病病毒核蛋白基因修饰株。例如，Hardyetal.通过重新组合Lambda赤斑热病毒和狂犬病病毒，构建了一种基因基因重排的株，这使得狂犬病病毒的各个基因的表达和混合变得更加灵活和方便。
在接下来的表达过程中，研究人员主要采用原核和真核系统来表达狂犬病病毒的核蛋白。原核表达系统包括大肠杆菌（E.coli），酵母表达系统则包括酵母菌（Pichiapastoris）和甜酵母（Saccharomycescerevisiae）；真核表达系统则包括哺乳动物细胞和昆虫细胞系统等。利用这些表达系统，可以生产大量的病毒核蛋白，为后续的单克隆抗体制备提供了有力保障。
3.狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体的制备
单克隆抗体是一类高特异性和高亲和力的抗体分子，可以特异性识别和结合特定的靶标蛋白。针对狂犬病病毒核蛋白的高特异性单克隆抗体的制备，主要分为以下几个步骤：
（1）免疫原制备：利用已经表达的狂犬病病毒核蛋白作为免疫原，选择适当的动物进行免疫。
（2）抗原与抗体的结合：用免疫动物血清进行初筛，选择阳性动物，然后提取其淋巴细胞。
（3）细胞融合产生杂交瘤：采用体外羊红细胞的刺激形成融合细胞，筛选得到单克隆抗体生产杂交瘤。
（4）筛选单克隆抗体：利用ELISA和WesternBlot等方法筛选出物种特异性和高亲和力的单克隆抗体。
（5）单克隆抗体的鉴定：对制备出的单克隆抗体，进行等电聚焦、SDS-PAGE、免疫印迹等检测，鉴定其特异性、亲和力和纯度等参数。
总的来说，狂犬病病毒核蛋白是狂犬病病毒RNA复制和装配的关键蛋白，对其修饰和表达的研究，为狂犬病的诊断和治疗提供了理论支持和实际保障；而制备出的高特异性和高亲和力的单克隆抗体，对于提高狂犬病的确诊水平和疫苗的开发等方面，也具有重要的应用价值。