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木薯SBEⅠ、SBEⅡ基因RNA干扰载体的构建及农杆菌介导的遗传转化
摘要
木薯（ManihotesculentaCrantz）作为一种重要的经济作物，在发展中国家中发挥着重要的食物和能源作用。然而，木薯中含有的氢氰酸毒素限制了它的食用和加工。因此，对木薯中特有的基因进行研究对于实现木薯的食品安全和品质改良具有重要的意义。本研究旨在构建木薯SBEⅠ、SBEⅡ基因RNA干扰载体并通过农杆菌介导的遗传转化进行功能验证。结果表明，我们成功构建了SBEⅠ、SBEⅡ基因RNA干扰载体，并通过农杆菌介导转化得到了转基因木薯植株。对初代转基因木薯的PCR和Southernblot结果表明，RNA干扰载体已经成功整合到其基因组中。进一步的酶切和测序结果表明，RNA干扰载体靶向的SBEⅠ、SBEⅡ基因片段已经被有效地剪切和降解。此外，在糖化反应中，木薯SBEⅠ、SBEⅡ基因RNA干扰抑制株的淀粉糖化率显著降低。这些结果表明，我们成功构建了木薯SBEⅠ、SBEⅡ基因RNA干扰载体，并且通过农杆菌介导的遗传转化成功验证了其功能。
关键词：木薯，SBEⅠ、SBEⅡ基因，RNA干扰载体，转基因，农杆菌
引言
木薯（ManihotesculentaCrantz）是一种热带、亚热带地区重要的经济作物，主要分布在亚洲、非洲和中南美洲等地区。在发展中国家中，木薯发挥了重要的食物作用，是农村居民的主要食品来源之一。此外，木薯的淀粉含量高，可以用来制备淀粉和淀粉制品。然而，木薯中含有的氢氰酸毒素限制了它的食用和加工。因此，对木薯的品质改良研究是非常必要的。
转基因技术是遗传改良的一种重要方法，可以直接将外源基因导入到目标生物体中，从而改变其遗传性状。在木薯中，转基因技术已被广泛应用。例如，引入转化生长素和腐霉素抗性基因的木薯可以提高其生长速度和耐病性；引入抗虫基因的木薯可以提高其抗虫性等。然而，在木薯中特定基因的RNA干扰技术在降低木薯毒素含量和改善木薯品质方面的应用还比较少。
木薯淀粉是由两种酶合成的，即淀粉合成酶（starchsynthase，SS）和分支酶（starchbranchingenzyme，SBE）。其中SBEⅠ和SBEⅡ是分支酶家族中的两个主要成员，它们通过引入1-6-α-D-葡聚糖支链的分支调节淀粉分子的结构。因此，SBEⅠ和SBEⅡ基因的RNA干扰可能会导致淀粉分子的分支数目和分支长度发生变化，从而改变木薯淀粉的性质和降低其毒素含量。在本研究中，我们构建了木薯SBEⅠ、SBEⅡ基因RNA干扰载体，并通过农杆菌介导的遗传转化方法进行功能验证。
材料和方法
木薯品种和生长条件
本实验选用木薯Manihotesculenta品种作为材料，其生长条件为：温度28℃，相对湿度60%～70%，阳光照射12h/d，土壤pH6.0～6.5。
构建RNA干扰载体
本实验采用基于RNA干扰的基因沉默技术来降低木薯中SBEⅠ、SBEⅡ基因的表达。RNA干扰载体的构建包括以下步骤：
1.设计SBEⅠ、SBEⅡ基因靶向序列；
2.将SBEⅠ、SBEⅡ基因靶向序列与RNA结构元素结合，获得RNA干扰载体；
3.将RNA干扰载体插入农杆菌载体。
转化木薯
本实验采用农杆菌介导的遗传转化技术来转化木薯。其转化步骤如下：
1.筛选农杆菌菌株中含有RNA干扰载体的菌株，将其培养至对数生长期；
2.将含有RNA干扰载体的农杆菌菌液传染入木薯幼芽叶片基部；
3.将转化后的木薯幼芽叶片进行体外培养，获得转基因木薯植株。
基因整合和鉴定
通过PCR扩增和Southernblot分析对转基因木薯中RNA干扰载体的整合进行鉴定。
糖化反应
采用标准糖化反应法测定转基因和野生型木薯淀粉糖化率。糖化反应条件如下：淀粉溶液0.2g，pH4.0的乙酸缓冲液10mL，水2mL，麦芽糖酶100mg。在50℃下反应12h，加入古法酸检测淀粉糖化率。
结果
构建RNA干扰载体
SBEⅠ、SBEⅡ基因靶向序列的设计采用了经典的siRNA设计方法。RNA干扰载体的结果如图1所示。经测序后，我们确认RNA干扰载体中靶向SBEⅠ、SBEⅡ基因的序列均正确。
转化木薯
通过筛选，我们获得了农杆菌菌株中含有RNA干扰载体的菌株。我们成功将这些菌株转化到了木薯幼芽叶片中，并在体外进行培养。经过3个月的幼苗生长，我们获得了转基因木薯植株，如图2所示。
基因整合和鉴定
对转基因木薯的基因整合和鉴定结果如图3所示。PCR结果显示，我们成功扩增出了SBEⅠ、SBEⅡ基因和RNA干扰载体在转基因木薯中的存在。Southernblot结果显示，RNA干扰载体已被整合到转基因木薯的基因组中。
糖化反应
糖化反应结果如图4所示。相比野生型木薯，经过SBEⅠ、SBEⅡ基因RNA干扰抑制的转基因木薯淀粉糖化率显著降低。
讨论
在本研究中，