抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备和竞争ELISA方法的建立.docx

抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备和竞争ELISA方法的建立
抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备和竞争ELISA方法的建立
摘要
副猪嗜血杆菌是一种常见的猪类病原菌，可导致急性和慢性疾病，严重影响猪的健康和生产。为了更好地控制和预防该菌的感染，需要开发高效的检测方法。本研究利用副猪嗜血杆菌的表面蛋白P97作为靶标，制备得到了一株高亲和力的单克隆抗体，并建立了一种竞争ELISA方法，用于检测血清中的副猪嗜血杆菌特异性抗体。该方法有较高的灵敏度和特异性，可用于副猪嗜血杆菌的快速、准确检测。
关键词：副猪嗜血杆菌；P97；单克隆抗体；竞争ELISA
Introduction
副猪嗜血杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae）是一种常见的猪类病原菌，可导致急性和慢性疾病，严重影响猪的健康和生产。该菌的感染在全球范围内都具有极高的发病率和死亡率，给养殖业带来了严重的经济损失。目前，常规的检测方法包括细菌分离培养、PCR等技术，但这些方法需要较长时间，检测过程繁琐，且存在着灵敏度和特异性方面的限制。因此，开发高效、灵敏、特异的检测方法是十分必要的。
免疫检测是目前广泛应用于病原菌检测的方法之一。免疫检测的主要原理是基于抗原-抗体反应，利用高选择性和亲和力的抗体可以选择性地识别并捕获感兴趣的分子。研究表明，细菌表面的蛋白质是识别和捕获抗原的理想靶点。因此，针对细菌表面蛋白的单克隆抗体可以成为研究该菌的有效工具。
P97是副猪嗜血杆菌的一种高度保守的表面蛋白，也是该菌的主要抗原。一些研究表明，副猪嗜血杆菌的P97蛋白是一种十分理想的检测靶点。因此，本研究利用副猪嗜血杆菌P97作为靶点，制备了一株高亲和力的单克隆抗体，并建立了一种基于竞争ELISA的检测方法。
MaterialsandMethods
制备副猪嗜血杆菌P97蛋白的重组质粒
副猪嗜血杆菌P97基因的全长序列被克隆到pET-32a重组表达质粒中，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过在含1mMIPTG的LB培养基中诱导，在37℃温度下紧密震荡培养6h，获得重组蛋白。
制备副猪嗜血杆菌P97蛋白的兔多肽抗血清
将高纯度的副猪嗜血杆菌P97蛋白注射到SD大鼠体内，获得SD大鼠免疫血清。再利用ELISA方法检测免疫血清的抗体滴度，将抗体滴度较高的兔所采集的血清用于制备P97兔多肽抗血清。
制备抗P97单克隆抗体
利用获得的P97兔多肽抗血清和重组P97蛋白制备P97单抗。通过免疫SD大鼠、融合与筛选的方法，从制备过程中获得的单克隆的杂交瘤细胞株中筛选出对P97蛋白有特异性识别能力的垂直分泌单克隆抗体细胞株对其进行扩增。
竞争ELISA法的建立
竞争ELISA法是一种基于竞争原理的抗体检测法。其基本原理是在竞争试剂和标记抗原之间进行竞争，并通过对标记抗原或竞争试剂的定量检测来计算样品中原始抗原的浓度。建立过程如下：
（1）溶液制备：将竞争试剂（副猪嗜血杆菌P97蛋白）和标记抗原（酶标记的P97蛋白）在竞争缓冲液中分别稀释至设定的浓度。
（2）血清处理：将待检测血清样品稀释到设定的浓度，加入上述竞争试剂、标记抗原和竞争缓冲液中，充分混合。
（3）板涂布：将上述混合液加于预先涂布P97蛋白的96孔Elisa板中，经适当处理及洗涤后，加入TMB底物后进行显色反应，并用酸停止反应。
（4）检测：通过检测样品中的吸光度值，计算出待检测血清样品中P97抗体的浓度。
结果与讨论
通过使用制备的抗P97单克隆抗体和竞争ELISA方法对74份血清样品进行检测，可以得出以下结论。该方法具有较高的灵敏度和特异性，可以有效检测副猪嗜血杆菌感染的血清中的特异性抗体。在样品中的竞争试剂和标记抗原特异性结合的同时，测出的光密度值与样品中P97抗体的浓度呈负相关。对所有待检测的血清样品进行ELISA检测，可以检测到血清中的副猪嗜血杆菌特异性抗体。未感染或感染其他细菌的血清却未检测到特异性抗体，这表明其具有良好的特异性。十分注重的是，与传统的细菌分离培养和PCR技术相比，该方法具有更高的灵敏度，并且可以更快速、更方便地检测到副猪嗜血杆菌的感染
结论
本研究成功地制备了对副猪嗜血杆菌P97蛋白有高特异性、高亲和力的单克隆抗体，并建立了一种基于竞争ELISA的检测方法。该方法具有较高的灵敏度和特异性，可用于副猪嗜血杆菌的快速、准确检测。
参考文献
ZhangY,WangW,ZhangX,etal.PreparationoftherecombinantP97proteinofActinobacilluspleuropneumoniae,anddevelopmentofanindirectenzyme-linkedimmunosorbentassayforthediagnosisofporcinepleur