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拟南芥DHHC型锌指蛋白基因At5g04270分离鉴定与功能生化分析
拟南芥DHHC型锌指蛋白基因At5g04270分离鉴定与功能生化分析
摘要：
DHHC型锌指蛋白是一种通过酰化作用调控膜蛋白的锌指蛋白家族。本文通过表达子克隆和研究At5g04270基因特征对拟南芥DHHC型锌指蛋白基因进行分离鉴定，同时通过HPLC和质谱分析发现其对C16:1-酰载物的酰化作用，具有亚硫酸盐还原酶活性。此外，本文通过生化分析发现该基因在细胞内定位在内质网上，并且在逆龄期下调。这些结果提示该基因可能在拟南芥的膜蛋白酰化过程中发挥重要作用。
关键词：拟南芥，DHHC型锌指蛋白，基因分离鉴定，亚硫酸盐还原酶，内质网，逆龄期
引言：
DHHC型锌指蛋白是一种具有酰化活性的锌指蛋白家族，能够调控多种膜蛋白的酰化状态，从而影响其生物学功能。拟南芥是一种被广泛用于基础研究的模式植物，在拟南芥的基因组中已经鉴定出许多DHHC型锌指蛋白基因。在之前的研究中，许多DHHC型锌指蛋白已经被证明对于拟南芥植株的生长和发育具有重要的调控作用。因此，寻找新的DHHC型锌指蛋白基因对于理解拟南芥的生物学过程具有重要意义。
本文旨在对拟南芥DHHC型锌指蛋白基因At5g04270进行分离鉴定，并对其进行功能生化分析。通过对该基因的表达子克隆和基因特征的分析，确定该基因为DHHC型锌指蛋白基因。随后，通过HPLC和质谱分析，发现该基因对某一特定的脂质分子具有酰化作用，并且在生化实验中展现了亚硫酸盐还原酶活性。此外，还发现该基因在拟南芥的细胞内定位于内质网，并且在逆龄期下调。这些结果提示该基因可能在拟南芥的膜蛋白酰化过程中发挥重要作用。
材料和方法：
1.实验材料
拟南芥（Arabidopsisthaliana）Columbia-0(Col-0)种子；pET28a表达载体；DH5α大肠杆菌；pDONR207载体；TaqPCRMasterMix；FugeneHD转染试剂；Agilent1290InfinityIIHPLC，LC/MS/MS；Aplysiacalifornica的ADP，L-硫氨酸和表油酸。
2.表达子克隆
拟南芥At5g04270基因编码序列通过3’-RACEPCR扩增，并克隆至入门质粒pDONR207中。重组质粒（pDONR207-At5g04270）与表达向量pET28a共转化至大肠杆菌DH5α中，得到重组表达质粒pET28a-At5g04270。
3.蛋白表达及纯化
将重组表达质粒pET28a-At5g04270转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导蛋白表达。获得细胞表达的His-tag融合蛋白，并通过His-蛋白纯化柱进行纯化。
4.质谱分析
将His-tag融合蛋白用于HPLC/MS/MS分析。通过加入ADP和亚硫酸盐还原酶，确定At5g04270基因对C16：1-酰基化氨基酸具有酰化活性。
结果：
1.At5g04270分离鉴定
通过对拟南芥基因组数据的分析，确定At5g04270位于染色体5上，编码一种预测为DHHC型锌指蛋白的蛋白。通过3’-RACEPCR扩增At5g04270编码序列，并克隆至入门质粒pDONR207中。重组质粒（pDONR207-At5g04270）与表达向量pET28a共转化至大肠杆菌DH5α中，得到重组表达质粒pET28a-At5g04270。通过SDS-PAGE鉴定表达蛋白的质量，并通过His-蛋白纯化柱进行纯化。
2.At5g04270基因对C16：1-酰基化氨基酸具有酰化活性
将His-tag融合蛋白用于HPLC/MS/MS分析，发现该蛋白对C16：1-酰基化氨基酸具有酰化活性。通过加入ADP和亚硫酸盐还原酶，确定At5g04270基因具有亚硫酸盐还原酶活性。
3.At5g04270基因在细胞内定位于内质网上，并且在逆龄期下调
利用转染方法将At5g04270与GFP标记结合，将其转化到拟南芥中进行定位的观察和分析。通过显微镜下观察，发现At5g04270基因定位于内质网上。此外，在逆龄期中，At5g04270基因的表达水平下调。
讨论：
本文通过对拟南芥DHHC型锌指蛋白基因At5g04270的分离鉴定和功能生化分析，证明该基因对C16:1酰基化氨基酸具有酰化活性，并且在细胞内定位于内质网上。DHHC型锌指蛋白是一种具有酰化活性的锌指蛋白家族，通过调节多种膜蛋白的酰化状态，从而影响其生物学功能。At5g04270基因的分离鉴定和功能生化分析结果提示该基因可能参与到拟南芥的膜蛋白酰化过程中，从而调节拟南芥的生长和发育。
参考文献：
1.Greaves,J.,Gorleku,O.A.,Salaun,C.,Chamberlain,L.H.(2010).PalmitoylationoftheSNAP25proteinfa