已烯雌酚和双烯雌酚单克隆抗体的制备及ELISA方法的研究.docx

已烯雌酚和双烯雌酚单克隆抗体的制备及ELISA方法的研究
摘要
已烯雌酚和双烯雌酚是一类重要的内源性雌激素，在人类和动物的生理过程中起到重要作用。本研究利用单克隆抗体技术成功制备了特异性对已烯雌酚和双烯雌酚识别的单克隆抗体，同时建立了一种便捷、敏感、特异性的ELISA方法，用于检测这两种雌激素在生物样品中的含量。该ELISA方法具有高灵敏度和可重复性，并被成功应用于猪尿样和人乳汁样的分析中。
关键词：已烯雌酚、双烯雌酚、单克隆抗体、ELISA、生物样品
Abstract
Ligand-bindingassays,suchasenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA),havebeenwidelyusedinthedetectionandquantificationofvarioushormones.Inthisstudy,monoclonalantibodieswereproducedandcharacterizedfortheirspecificrecognitionofestroneandestradiol,twoimportantendogenousestrogens.Animmunoassaywasthendevelopedusingthemonoclonalantibodiestodetectandquantifythelevelsofthesetwoestrogensinbiologicalsamples.TheELISAmethoddevelopedinthisstudydemonstratedhighsensitivity,specificity,andreproducibility,anditwasappliedsuccessfullytotheanalysisofpigurineandhumanmilksamples.
Keywords:estrone,estradiol,monoclonalantibody,ELISA,biologicalsamples
引言
内源性雌激素对维持生殖健康、性别分化和内分泌平衡等方面具有重要作用。已烯雌酚和双烯雌酚作为两种内源性雌激素，广泛存在于人类和动物的生理过程中。在临床和研究领域，检测这两种雌激素的含量是非常重要的。然而，已烯雌酚和双烯雌酚存在于生物样品中的含量很低，常常需要使用敏感的定量方法进行检测。单克隆抗体技术在雌激素的检测中发挥了重要作用，具有高特异性和灵敏度等优点。同时，ELISA技术是当前最为常用的雌激素定量方法之一，其具有高灵敏度、高特异性和高样品处理能力等优点。
本研究利用单克隆抗体技术制备了特异性识别已烯雌酚和双烯雌酚的单克隆抗体，并建立了一种便捷、敏感、特异性的ELISA方法，用于检测这两种雌激素在生物样品中的含量。通过对猪尿样和人乳汁样进行的分析，验证了该ELISA方法的高灵敏度和可重复性。
材料与方法
1.化学品和仪器
已烯雌酚、双烯雌酚、BSA和其它化学品均为分析纯品，购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。ELISAsubstratesandstreptavidin-HRPwerepurchasedfromBDBiosciences(SanJose,CA).其它生化试剂购自Solarbio(Beijing,China)。NuncMaxisorpplateswerepurchasedfromThermoFisherScientific(Waltham,MA)。Samplesofpigurineandhumanmilkwerecollectedandstoredat–80°Cuntilanalysis.
2.单克隆抗体制备
制备已烯雌酚和双烯雌酚的小鼠单克隆抗体，具体方法参考先前描述的文献。[1]
3.建立ELISA检测方法
3.1抗原包被
0.1%BSA-PBS沉淀溶液中加入1ng/mL的已烯雌酚或双烯雌酚，并在4°C下过夜包被在NuncMaxisorp平板上。洗板液为PBS-T（0.05%Tween20inPBS）。
3.2单克隆抗体识别
在包被的平板上分别加入1ng/mL已烯雌酚或双烯雌酚的抗原，自由结合位点加入4μg/mL单克隆抗体，并在室温下孵育2小时。
3.3检测体系
加入生物样品和streptavidin-HRP探针。孵育30分钟。最后加入ELISA底物进行反应，分析发色反应后的吸光度值。
4.样品分析
样品采用抗酸稀释的方法脱蛋白，差减方法测定样品单项差值。
结果
1.单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备参考自先前的报道。经过筛选，获得了可以高度识别已烯雌酚或双烯雌酚的单克隆抗体。
2.ELISA检测法的建立和优化
比较不同条件下ELISA的灵敏度，以最优反应条件下的检测灵敏度为