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家蚕中一个新的膜蛋白基因HW的融合表达和纯化
摘要
膜蛋白是细胞膜的主要成分之一，在细胞的许多生命过程中起着重要作用。本文研究了家蚕中一个新的膜蛋白基因HW的融合表达和纯化。通过PCR扩增，将HW基因克隆到表达载体pET-30a+上，构建了重组表达质粒pET-30a+-HW。接下来，将pET-30a+-HW转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并进行表达。利用Ni2+亲和柱纯化出表达的融合蛋白，并进行SDS-PAGE和Westernblot分析，证明融合蛋白的分子量约为24kDa。通过这些实验，本研究成功地获得了纯化的HW融合蛋白，并为深入研究HW蛋白的功能奠定了基础。
关键词：膜蛋白、融合表达、纯化、家蚕、HW基因
Abstract
Membraneproteinsareoneofthemaincomponentsofcellmembranesandplayimportantrolesinmanylifeprocessesofcells.Inthisstudy,weinvestigatedthefusionexpressionandpurificationofanewmembraneproteingeneHWinsilkworms.HWgenewasclonedintotheexpressionvectorpET-30a+byPCRamplificationtoconstructtherecombinantexpressionplasmidpET-30a+-HW.Next,pET-30a+-HWwastransformedintoE.coliBL21(DE3)forexpression.TheexpressedfusionproteinwaspurifiedusingaNi2+affinitycolumn,anditsmolecularweightwasabout24kDaasdeterminedbySDS-PAGEandWesternblotanalysis.Withtheseexperiments,thisstudysuccessfullyobtainedpurifiedHWfusionprotein,whichlaysafoundationforfurtherinvestigationofthefunctionoftheHWprotein.
Keywords:membraneprotein,fusionexpression,purification,silkworms,HWgene
引言
膜蛋白是细胞膜中占据主要成分的一类蛋白质，在细胞的各种生物过程中起着重要作用。膜蛋白包括许多种类，其结构和功能各异，为细胞的多种生理和代谢过程提供了支持和保障。由于其复杂的结构和困难的纯化，膜蛋白的研究一直是生物学和生物医学研究的热门领域之一。
近年来，通过基因工程技术的发展，膜蛋白的融合表达和纯化越来越多地采用了异源表达系统，如大肠杆菌等细菌系统等，在表达量和纯化效果方面取得了很大的进展。在这些系统中，通常需要将目标基因与表达载体融合，使目标蛋白与表达载体蛋白或其它标签蛋白相结合，从而便于纯化。
家蚕是经济价值和温和的研究模型，具有体内的异肽合成和分泌功能，可用于高效表达蛋白与获得复杂膜蛋白囊泡等。本研究通过分子克隆技术，将家蚕中一个新的膜蛋白基因HW克隆到表达载体中，并在大肠杆菌系统中进行表达和纯化。通过这些实验，为进一步了解HW蛋白的功能提供了基础。
材料和方法
材料
-重组表达质粒pET-30a+
-大肠杆菌BL21(DE3)菌株
-IPTG
-Ni2+亲和层析柱
-His标签抗体
-PCR扩增试剂盒
方法
1.克隆基因
家蚕中一个新的膜蛋白基因HW的序列在NCBI序列库中，序列号为NM_001276822.1。利用该序列设计引物，并利用PCR扩增技术将它克隆到重组表达质粒pET-30a+上。PCR反应使用PrimeSTARMaxDNAPolymerase(Takara)进行，反应情况为：95℃预热10min，95℃应用30s，60℃应用30s,72℃应用45s，共循环30次。取一个生长良好的大肠杆菌BL21（DE3）菌落进行扩增，PCR产物通过电泳纯化，连接到T5转录起始子的5’端，并测序鉴定。
2.表达和纯化融合蛋白
将pET-30a+-HW重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行表达，表达菌株在取得合适的OD600值后，加入0.1mMIPTG刺激进一步表达。将菌株进行机械打碎，利用Ni2+亲和柱进行纯化，以纯化后的融合蛋白作为实验样本。确认融合蛋白的纯度和分子量，使用直接染色SDS-PAGE和Westernblot分析。在分别加入His标签抗体和HRP标签的二抗后进行发色和观察。
结果
1.克隆基因
成功地获得了家