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多角体融合的家蚕表皮膜蛋白N141的高效表达与纯化
引言
家蚕表皮膜蛋白（Bombyxmorisilkproteins）是家蚕丝绸形成的主要成分，其独特的物理和化学性质使其成为工业和医疗领域中广泛研究的对象。家蚕表皮膜蛋白由三种不同的蛋白组成：丝素蛋白（fibroin）、箔蛋白（sericin）和黄蛋白（p25）。其中，丝素蛋白质量最大，约为约350kDa，占据重量分数的75%~80%，因此是研究的重点。丝素蛋白由两种亚基组成，分别是Fib-H和Fib-L，其中Fib-H亚基分子量约为285kDa，Fib-L亚基分子量约为25kDa。丝素蛋白的生物合成是在家蚕体内，利用家蚕中肠中的产丝腺合成，以专门的迅速扩张技术去提取丝素蛋白，并制备成各种产品。
目前，丝素蛋白在材料学、药物输送、生物医学和组织工程学等领域具有广泛的应用。但是，丝素蛋白的高成本和困难的纯化仍然是其应用受到限制的问题。因此，开发高效表达和纯化丝素蛋白的新方法具有重要的应用价值。
本文研究了多角体融合的家蚕表皮膜蛋白N141的高效表达和纯化方法，并对纯化过程进行了性质鉴定和结构分析，为丝素蛋白的应用提供了新思路。
方法
1.质粒构建
本实验使用pET-28a(+)载体构建多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141表达质粒。多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141的编码序列通过PCR扩增，并在其N端引入了6个组氨酸（His）标签。引物的序列如下：
引物1：5'-ATGAAGGTAGCGTTGCAGCGAAG-3'
引物2：5'-TCAGCTTTTCATCTTGTGGGT-3'
2.蛋白表达
将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，并通过IPTG诱导表达。将细胞在37°C下生长至OD600=0.6时，添加1mM的IPTG，继续在30°C下震荡生长12h，然后通过离心采集菌体。获得的菌体被重悬于缓冲液中，含有50mMTris-HCl（pH8.0），500mMNaCl和10mMImidazole，加上1%TritonX-100和1mMPMSF，并在冰上振荡裂解。裂解后将异相液离心获得可溶性部分。
3.亲和层析纯化
通过Nickel-NTA亲和层析柱（Qiagen）将可溶性部分纯化。柱洗液的含有50mMTris-HCl（pH8.0），500mMNaCl和30mMImidazole。洗液中的His标签可与珀金氏蓝（Ni2+）有选择地配位，从而与融合表达的蛋白质结合。然后，在洗液中含有500mMImidazole时，可将蛋白酶析出洗脱。
4.SDS-PAGE分析和电泳转移
通过SDS-PAGE检测纯化的蛋白质的分子量。并通过电泳转移，将蛋白质转移到PVDF膜上，以进行Western印迹。斑点制备时，可将蛋白质溶液在Gel中加入0.1%TritonX-100，以预防凝聚。
结果与讨论
1.构建家蚕表皮膜蛋白多角体融合N141表达质粒
本实验通过PCR扩增了多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141的编码序列，并在其N端引入了6个组氨酸标签。多角体融合是利用多个丝素蛋白亚基的特定序列进行拼接，以形成更稳定的纤维构型，从而提高丝素蛋白的物理和化学性质。通过引入6个组氨酸标签，可以方便地纯化蛋白质并跟踪蛋白质的表达情况。
2.表达和纯化多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141
在重悬菌体后，可获得可溶性部分。然后，通过Nickel-NTA亲和层析柱可将多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141纯化到较高的纯度。从蛋白质SDS-PAGE凝胶中可以看出，通过亲和层析纯化得到了大量的目的蛋白质，且几乎没有杂质。这表明多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141可高效表达并通过简单的纯化步骤获得高纯度的蛋白。
3.蛋白纯化的性质鉴定和结构分析
通过Western印迹可以确定纯化的多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141含有His标签。此外，利用激光散射仪（DLS）和动态光散射（DLS）技术，分析多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141的粒径分布和多角体形成的结果表明，经过Nickel-NTA亲和层析柱纯化后，获得的多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141是高度稳定的。多角体形成的整体结构可能通过以α螺旋序列为核心而聚集在一起而形成。多角体化可延长丝素蛋白的半衰期并降低丝素蛋白的毒性，这是多角体化技术的优势之一。
结论
本研究开发了多角体融合的家蚕表皮膜蛋白N141的高效表达和纯化方法，并成功获得了高纯度、高稳定性的多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141。此外，本实验方法的优势在于简单、高效、可重复性强，为进一步开发丝素蛋白的应用提供了可能。未来，应该继续对多角体融合家蚕表皮膜蛋白N141的性质和应用进行更深入的研究。